1、鼻咽癌是一種與EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染密切相關的鼻咽上皮惡性腫瘤，然而EBV促進鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的確切機制還沒有完全闡明。最近有證據(jù)指出一類由EBV編碼的微小RNA(microRNA，miRNA)分子可能參與了EBV介導的鼻咽上皮惡性轉化，從而影響鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展。目前已發(fā)現(xiàn)EBV可編碼25個miRNAs前體，加工成44個成熟的miRNAs，且EBV編碼的miRNAs在EBV基因組上成簇分布，可以分為B
2、ART和BHRF1兩組。但鼻咽癌中對于EBV編碼miRNAs的研究還不是很透徹，44個成熟的EBV miRNAs中大部分還沒有功能研究的報道。
為了確定EBV編碼的miRNA如何調控宿主基因的表達，了解EBV miRNA在鼻咽上皮惡性轉化中潛在的作用機制，本課題構建了鼻咽癌和正常對照組織中EBV編碼的全部44個成熟miRNAs的表達譜;對這些EBV miRNAs和它們潛在的宿主靶基因進行分析，構建了EBV miRNA和它們宿主
3、靶基因之間的調控網絡;最后，從中挑選了EBV miRNAs BART10及其靶基因BTRC進行初步驗證。
1、構建EBV miRNAs的表達譜通過Real-time PCR技術檢測了鼻咽癌、正常對照組織及相關細胞系中EBV編碼的miRNAs表達水平，同時檢測了兩個EBV編碼的蛋白表達基因LMP1和EBNA1以作為參照。所檢測的樣品包括16例鼻咽癌活檢組織（其中臨床TNM分期第Ⅱ期5例，Ⅲ期5例，Ⅳ期6例）、5例正常對照組織（來
4、自鼻咽慢性炎癥患者活檢標本）及5株細胞系（EBV陰性的鼻咽上皮永生化細胞NP69和鼻咽癌細胞HK-1，EBV陽性的鼻咽癌細胞C666-1、淋巴瘤細胞Raji及狨猴B細胞B95-8）。發(fā)現(xiàn)正常鼻咽上皮組織和EBV陰性的細胞系中，均檢測不到EBV編碼miRNAs及LMP1、EBNA1的表達;而16例鼻咽癌組織及EBV陽性細胞系中，都有BART組40個EBV miRNAs及LMP1、EBNA1的表達，其中14例鼻咽癌組織為高表達;BHRF1組
5、miRNAs則僅在B細胞來源的細胞系Raji及B95-8中有表達，在上皮來源的組織和細胞（不論是正常鼻咽上皮還是鼻咽癌）中均不表達。
2、預測EBV miRNA的宿主靶基因由于BHRF1組的miRNAs在鼻咽癌及對照組織中均不表達，我們只對BART組的EBV miRNAs利用TargetScan和RepTar兩個生物信息學軟件進行了宿主靶基因的預測;TargetScan預測發(fā)現(xiàn)BART組EBV miRNAs共有5569個潛在的
6、宿主靶基因，而RepTar預測了6494個BART組EBV miRNAs潛在的宿主靶基因，其中兩個軟件共同預測出的潛在宿主靶基因有3140個。EBV BART組40個成熟miRNAs中，BART-18-5p有148個潛在的宿主靶基因，數(shù)目最多，而BART-8、BART-13*和BART-19-3p則沒有預測到潛在的宿主靶基因。將這3140個潛在的宿主靶基因輸入DAVID軟件中進行功能聚類分析，發(fā)現(xiàn)這些靶基因涉及axon guidance
7、、pathways in cancer、the Wnt signalingpathway、regulation of the actin cytoskeleton及adherens function等信號通路。
3、EBV miRNAs潛在宿主靶基因與鼻咽癌轉錄組數(shù)據(jù)的整合分析盡管我們預測了EBV BART組miRNAs可能調控3140個宿主靶基因的表達，但生物信息學預測的結果需要實驗證據(jù)的進一步支持和驗證。大多數(shù)情況下miR
8、NAs是其靶基因的負調控因子，由于EBVBART組miRNAs在鼻咽癌中都是表達上調的，那么它們的宿主靶基因理論上將表達下調。為此，我們利用SAM軟件重新分析了本實驗室已有的鼻咽癌全基因組表達譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與正常對照組織相比，鼻咽癌中有732個基因的表達顯著失調，其中上調基因270個，下調基因462個。將462個鼻咽癌中顯著下調的基因與預測出的3140個EBVmiRNAs潛在宿主靶基因進行比較，最后發(fā)現(xiàn)105個基因在鼻咽癌中顯著下調，且它
9、們的mRNA也被兩個生物信息學工具TargetScan和RepTar同時預測到具有EBV miRNAs的結合位點，因此這105個基因最有可能是EBV miRNAs在鼻咽癌細胞中真正的宿主靶基因。
4、繪制EBV miRNA和宿主靶基因間的調控網絡我們對這105個在鼻咽癌中表達下調且具有EBV miRNAs結合位點的基因進行進一步分析，發(fā)現(xiàn)40個EBV BART miRNAs中有28個miRNAs至少靶向這105個基因中的一個，
10、其中BART-22有37個靶基因、BART-8*有23個、BART-18-5p有12個、BART-9和BART-14各有11個靶基因。類似的，有些基因如ATRX、BTRC、CTBP2、FOXP1和NFIB等在它們mRNA的3'-非翻譯區(qū)有多個EBV miRNAs的結合位點。在這105個宿主基因和28個EBV BART miRNAs中我們一共找到了175個miRNA:mRNA對，為了充分展示EBV miRNAs和宿主基因mRNA間的調控關
11、系，我們利用Pajek軟件繪制了它們間的調控網絡圖。
5、初步驗證BTRC是EBV miRNA BART-10的靶基因本研究室曾朝陽副研究員等通過全基因組表達譜分析并經組織微陣列大樣本驗證了鼻咽癌中WNT信號通路的異常激活與EBV的感染密切相關，本課題中我們發(fā)現(xiàn)WNT通路中關鍵分子BTRC是EBV miRNAs的潛在靶基因，且在鼻咽癌中顯著下調，因此本課題中我們初步驗證了EBV miRNAs對BTRC的調控。盡管BTRC基因3
12、'-非翻譯區(qū)預測有多個EBV miRNAs的結合位點，我們經過初步實驗發(fā)現(xiàn)只有EBV miRNA BART-10對BTRC的調控作用最為明顯。在鼻咽癌和正常對照臨床樣本中，我們發(fā)現(xiàn)EBV miRNA BART-10與BTRC的表達顯著負相關;在鼻咽癌細胞系中轉染EBV miRNABART-10的mimics后，通過Real-time PCR和Western blotting我們在mRNA和蛋白水平都驗證了EBV miRNA BART-1
13、0能下調內源性BTRC的表達;最后，采用熒光素酶報告基因實驗我們證實了EBVmiRNA BART-10確實可以靶向BTRC mRNA的3'-非翻譯區(qū)直接調控該基因的表達。以上結果表明在鼻咽癌中BTRC下調的原因很可能就是受到EBV miRNA BART-10的調控，并進一步通過BTRC下游信號通路級聯(lián)反應而發(fā)揮生物學效應。
綜上所述，本課題繪制了一個全面的EBV編碼miRNAs的表達譜，并通過生物信息學預測結合鼻咽癌轉錄組數(shù)據(jù)
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