玉米抗旱miRNAs及其靶基因的發(fā)掘與功能驗(yàn)證.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類(lèi)非編碼的內(nèi)源小RNA分子，在生物體的生命活動(dòng)中起著重要的調(diào)控作用。miRNAs通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)來(lái)參與生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、分化增殖和細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過(guò)程?，F(xiàn)在對(duì)于植物miRNA的研究仍然以擬南芥、水稻等模式植物為主，但是在其他一些植物中仍然有大量的物種特異的miRNA沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)。玉米是全世界種植最廣泛的作物，同時(shí)也是重要的糧食作物之一，而干旱是限制玉米產(chǎn)量的主要因素之一，抗旱育種一直是研究者們重要的育

2、種目標(biāo)，因此通過(guò)耐旱miRNA的鑒定來(lái)挖掘抗旱相關(guān)功能基因不僅有助于深入理解玉米抗旱機(jī)制，而且對(duì)培育玉米抗旱新品種提供有效途徑。本研究通過(guò)利用高通量測(cè)序技術(shù)鑒定兩個(gè)玉米自交系中差異表達(dá)顯著的新miRNAs，并對(duì)差異表達(dá)顯著的新miRNAs進(jìn)行分析和靶基因的預(yù)測(cè),在此基礎(chǔ)上利用轉(zhuǎn)基因方法過(guò)量表達(dá)miRNA的靶基因來(lái)進(jìn)行功能鑒定和作用機(jī)制分析。獲得如下主要結(jié)果：
　　1、通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)總共鑒定了192個(gè)玉米miRNAs，包括124

3、個(gè)已知的miRNAs和68個(gè)新的miRNAs。68個(gè)新的miRNAs中有18個(gè)miRNAs的序列頻率極低并且長(zhǎng)度超過(guò)24 nt，莖環(huán)引物熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)果顯示14個(gè)miRNAs在兩個(gè)玉米自交系中檢測(cè)到表達(dá)量。
　　2、對(duì)鑒定的192個(gè)玉米miRNAs進(jìn)行篩選得到了29個(gè)在兩個(gè)玉米自交系中差異顯著性表達(dá)的miRNAs，包括18個(gè)下調(diào)miRNAs和11個(gè)上調(diào)miRNAs，其中有5個(gè)新的miRNAs：PC-3p-190, PC-3p

4、-104764, PC-3p-129630, PC-3p-552502和PC-5p-139812。對(duì)這5個(gè)新miRNAs進(jìn)行靶基因的預(yù)測(cè)和GO注釋分析，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)的9個(gè)靶基因中，7個(gè)靶基因的GO注釋可以劃分為21個(gè)生物學(xué)過(guò)程，包括固碳作用、光合作用、蛋白水解作用等，而另外兩個(gè)靶基因沒(méi)有預(yù)測(cè)到任何生物學(xué)功能。此外，5個(gè)miRNAs中有4個(gè)miRNAs擁有共同的靶基因(GRMZM2G448344)， PC-3p-104764和 PC-3p-1

5、29630也擁有共同的靶基因(GRMZM2G360821 and GRMZM2G308907)，且這些靶基因都參與光合作用。
　　3、根據(jù)已公布的玉米18個(gè)組織的RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)9個(gè)靶基因進(jìn)行表達(dá)模式的分析，結(jié)果顯示9個(gè)靶基因具有不同的表達(dá)模式，但是都只在葉片中表達(dá)，其中GRMZM2G360821和 GRMZM2G308907的表達(dá)水平最高，說(shuō)明這些靶基因可能在植物的光合作用中扮演著重要的角色，而這與上述靶基因的GO注釋

6、分析結(jié)果相一致。
　　4、通過(guò)Stem-loop RT-PCR方法檢測(cè)到ZmmiR139的表達(dá)量與其靶基因ZmDST44的表達(dá)量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，初步驗(yàn)證ZmDST44是ZmmiR139的靶基因；然后利用5'RACE方法驗(yàn)證ZmmiR139對(duì)ZmDST44的剪切作用，通過(guò)測(cè)序得到有41個(gè)測(cè)序結(jié)果正確且其剪切位點(diǎn)為同一位置。因此，通過(guò)Stem-loop RT-PCR及5’-RACE實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了ZmmiR139及其靶基因ZmDST44之間的

7、相互作用。
　　5、過(guò)量表達(dá)ZmDST44的轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥在正常條件下的生長(zhǎng)表型沒(méi)有明顯差異，而干旱脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥相對(duì)于野生型具有明顯的抗旱表型；通過(guò)測(cè)定野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株在PEG6000處理下的萌發(fā)率和在干旱脅迫條件下的丙二醛含量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株在PEG6000處理下的萌發(fā)率顯著高于野生型植株，四個(gè)轉(zhuǎn)基因株系在干旱脅迫條件下的丙二醛含量均顯著低于野生型植株，說(shuō)明過(guò)量表達(dá)ZmDST44能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因擬

8、南芥的耐旱性。
　　6、過(guò)量表達(dá)ZmDST44的轉(zhuǎn)基因水稻和野生型水稻在正常條件下的生長(zhǎng)表型沒(méi)有明顯差異，而干旱脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因水稻相對(duì)于野生型具有明顯的抗旱表型。此外，在干旱脅迫過(guò)程中，轉(zhuǎn)基因水稻的葉片相對(duì)含水量顯著高于野生型植株，表明過(guò)量表達(dá)ZmDST44可以提高植株在干旱脅迫條件下的保水能力。復(fù)水試驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系的存活率顯著高于野生型株系。結(jié)合以上結(jié)果，說(shuō)明過(guò)量表達(dá)ZmDST44基因能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱能力