小麥抗旱相關(guān)基因TaPP2Ac-a的分離、定位與功能驗證.pdf

1、干旱脅迫是限制世界作物生產(chǎn)的主要環(huán)境因子之一,它嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和栽培范圍.解決這個問題的有效途徑之一是培育和利用優(yōu)良的耐旱作物品種.應(yīng)用分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等方法研究作物抗旱機制,分離耐旱基因,并通過基因工程培育耐旱作物品種已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究的重要目標(biāo). 為了深入研究植物響應(yīng)干旱的分子機制,本實驗室以強抗旱小麥品種早選10號為試驗材料,利用SSH法構(gòu)建了小麥幼苗水分脅迫應(yīng)答cDNA文庫.本研究首次從中分離到小麥蛋白磷酸酶

2、2A(PP2A)~個亞基的表達(dá)序列,進(jìn)一步克隆并定位了相關(guān)的基因,深入研究其表達(dá)特性及與植物干旱響應(yīng)的關(guān)系.其主要研究結(jié)果包括: 1.克隆了解小麥蛋白磷酸酶2A催化亞基基因TaPP2Ac-1的兩個全長cDNA TaPP2Ac-J-2和TaPP2Ac-1-3序列,它們編碼相同的蛋白,分子量為36kDa,等電點為5.03.蛋白比對和聚類分析結(jié)果表明,TaPP2Ac-1具有PP2Ac蛋白保守的岡田酸(okadaic acid,OA)結(jié)

3、合位點,與水稻OsPP2A-4的同源性最高.TaPP2Ac-1的轉(zhuǎn)錄與干旱脅迫相關(guān),其表達(dá)也受高鹽、低溫和外源ABA脅迫的誘導(dǎo).Southern雜交顯示TaPP2Ac-1基因以單拷貝形式存在于普通小麥的單個基因組上.利用缺四體材料分別將TaPP2Ac-1-1、TaPP2Ac-1-2和TaPP2Ac-1-3定位在染色體4A、4B和4D上.利用重組近交系將其中的TaPP2Ac-1-3基因精確定位在普通小麥4D長臂上,位于標(biāo)記Xbed15-4

4、D和Xfbb178-4D之間,與它們的遺傳距離分別為6.9cM和6.2cM.我們以TaPP2Ac-1-3為例,對TaPP2Ac-1的表達(dá)和功能進(jìn)行了深入的研究,結(jié)果顯示TaPP2Ac-1-3主要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá),是一個活性的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶.在水分脅迫條件下,過量表達(dá)TaPP2Ac-1-3基因的轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出較強的抗旱性,具有較高的葉片相對含水量(RWC)、葉片細(xì)胞膜完整性指數(shù)(MSI)、離體葉片保水力(WRA)和水分利

5、用效率(WUE).同樣,轉(zhuǎn)基因的擬南芥在種子萌發(fā)期、幼苗期和成株期都比野生型具有較強的耐干旱、鹽、甘露醇等滲透脅迫的能力,說明TaPP2Ac-1基因參與對干旱和滲透脅迫的響應(yīng). 2.克隆了小麥蛋白磷酸酶 2A 另一個結(jié)構(gòu)亞基基因TaPP2Aa-1的兩條全長cDNA,TaPP2Aa-1-1和TaPP2Aa-1-2,它們僅有12bp的插入/缺失差異,TaPP2Aa-1在六倍體小麥D基因組上的長度約5.5kb,包括12個外顯子和11個

6、內(nèi)含子.蛋白比對和聚類分析結(jié)果顯示TaPP2Aa-1與水稻OsPP2Aa(Q9S7CS)的親緣關(guān)系最近,其序列中含有15個不完全一致的重復(fù)單元,每個單元大約39個氨基酸殘基.TaPP2Aa-1-2也在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá).PEG、鹽、低溫和ABA也誘導(dǎo)TaPP2Aa-1基因的表達(dá),且該基因的原核表達(dá)產(chǎn)物可賦予重組菌株較強的耐滲透脅迫能力.轉(zhuǎn)TaPP2Aa-1-2基因的煙草植株具有明顯的耐干旱特性,在干旱脅迫條件下,比野生型萎蔫程度輕,葉