鼻咽癌T7噬菌體cDNA文庫的構(gòu)建和鼻咽癌血清自身抗體的篩選.pdf

1、鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種上皮源性的高發(fā)于我國南方及東南亞一帶的頭頸部惡性腫瘤，在我國廣東、廣西、福建、湖南、江西尤為突出，據(jù)估計(jì)全世界鼻咽癌病例中80％發(fā)生于我國，年發(fā)病率為10-25/10萬。由于鼻咽癌起病隱匿，部位特殊，早期癥狀缺乏特異性，導(dǎo)致早期診斷十分困難，通常在鼻咽癌確診時(shí)，70％以上的患者局部已經(jīng)高度惡性或擴(kuò)散到淋巴結(jié)，已屬于臨床中晚期。因此，早期診斷鼻咽癌將極大提高鼻咽癌的治

2、愈率和提高患者預(yù)后。 許多蛋白質(zhì)在腫瘤組織中高表達(dá)，這些蛋白質(zhì)能刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體，這些自身抗體比腫瘤蛋白質(zhì)更容易檢測，因此將常規(guī)檢測這些高表達(dá)的蛋白質(zhì)改為檢測腫瘤患者體內(nèi)針對這些腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體是一種更有效的策略。相當(dāng)部分的自身抗體作為腫瘤的診斷和預(yù)后判斷的指標(biāo)有著潛在的價(jià)值，如抗BRD2和α-甲基-輔酶A消旋酶(alpha-methylacy1-CoA racemase，AMACR)自身抗體用于前列腺癌的診斷，

3、抗AnnexinⅪ-A和Grb2相關(guān)蛋白自身抗體用于乳腺癌的診斷，抗表皮細(xì)胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule，Ep-CAM)和肌酸激酶B(creatine kinase B，CKB)自身抗體用于卵巢癌的診斷等。目前在鼻咽癌中也發(fā)現(xiàn)了一些高表達(dá)的蛋白質(zhì)，如fibronectin、Mac-2BP、plasminogen、和zinc-alpha(2)-glycoprotein(ZAG)等，提示一系列

4、的針對這些高表達(dá)蛋白質(zhì)的自身抗體有可能用于鼻咽癌的診斷和監(jiān)測，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。因此研究針對鼻咽癌特異性或者相關(guān)性腫瘤抗原的自身抗體將大大提高鼻咽癌的診斷效率，這些自身抗體有望作為鼻咽癌的腫瘤標(biāo)志物。首先，探討了鼻咽癌患者血清中是否存在抗鼻咽癌自身抗原的抗體，為尋找鼻咽癌新的腫瘤標(biāo)志物提供依據(jù)。以Epstein-Barr病毒陰性的鼻咽癌細(xì)胞株CNE1細(xì)胞為固相抗原板，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)分析其與32例鼻咽癌患者血清和54例正

5、常血清反應(yīng)的差異性；提取CNE1總蛋白，Western印跡分析其與鼻咽癌患者血清反應(yīng)是否存在特異性的蛋白質(zhì)。 EIASA分析結(jié)果顯示鼻咽癌患者血清平均OD405值(0.904±0.032)明顯高于正常人血清平均OD405值(0.736±0.028)(P＜0.01)；Western印跡分析發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者血清與正常人血清相比，部分陽性條帶位置一致，但條帶陽性強(qiáng)度增加，還發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)了部分新的陽性條帶，這些條帶可能屬于鼻咽癌相關(guān)抗原或鼻咽

6、癌特異性抗原。說明鼻咽癌患者血清中存在抗鼻咽癌自身抗原的抗體，這些抗體并非針對Epstein-Barr病毒，為尋找鼻咽癌血清腫瘤標(biāo)志物提供了依據(jù)。 其次，用8例病理確診的鼻咽癌組織活檢標(biāo)本構(gòu)建鼻咽癌T7噬菌體cDNA文庫，然后再利用來源于鼻咽癌臨床分期在Ⅱ-Ⅳ期患者的血清和正常人血清進(jìn)行生物淘洗，并將生物淘洗獲得的22個(gè)噬菌體重組蛋白進(jìn)行免疫印跡和ELISA實(shí)驗(yàn)鑒定。隨后通過ELISA分析鼻咽癌患者和正常人血清中的5個(gè)抗噬菌體重

7、組蛋白自身抗體的水平，ROC分析這些自身抗體作為鼻咽癌診斷標(biāo)志物的特異性和敏感性。 結(jié)果成功構(gòu)建了鼻咽癌混合組織T7噬菌體cDNA文庫，原始庫容量為8.0×107pfu/ml，放大后的庫容量為3.47×1010pfu/ml，為生物淘洗奠定了基礎(chǔ)。利用鼻咽癌患者血清和正常人血清經(jīng)生物淘洗分離了31個(gè)腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)，DNA序列分析顯示這31個(gè)蛋白質(zhì)中有22個(gè)為獨(dú)立的與己知或者假定的蛋白質(zhì)相匹配。說明通過生物淘洗能有效富集與鼻咽癌患者

8、血清發(fā)生反應(yīng)的蛋白質(zhì)，而這些蛋白質(zhì)不與正常人血清發(fā)生反應(yīng)，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供了依據(jù)。 RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)BMI-1基因在7株不同的鼻咽癌細(xì)胞株中均有不同程度的表達(dá)，而在正常鼻咽上皮細(xì)胞株NP69中不表達(dá)。隨后以BMI一1噬菌體重組蛋白與鼻咽癌患者血清進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果顯示在不同的鼻咽癌患者血清中存在不同滴度的抗BMI-1自身抗體，且抗BMI-1自身抗體與BMI-1具有良好的親合力。進(jìn)一步ELISA檢測鼻咽癌血清中抗BMI-1

9、自身抗體的水平，發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌患者血清中，抗BMI-1自身抗體平均OD405值為0.791±0.025，而在正常人血清中平均OD40s值為0.488±0.042，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析二者之間具有顯著性差異(P<0.01)。ROC分析曲線下面積為0.8044，說明抗BMI-1自身抗體作為鼻咽癌診斷的標(biāo)志物，具有良好的特異性和敏感性。以鼻息肉患者血清為對照，進(jìn)一步分析抗BMI-1自身抗體與鼻咽癌臨床資料之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)抗BMI-1自身抗體與鼻咽癌的轉(zhuǎn)移

10、有密切關(guān)系，在原位鼻咽癌患者血清中的水平與鼻息肉患者血清水平相比，具有顯著性差異(P<0.01)，提示抗BMI-1自身抗體有可能作為鼻咽癌的早期診斷標(biāo)志物。在探討抗BMI-1自身抗體作為鼻咽癌標(biāo)志物的基礎(chǔ)上，又進(jìn)一步檢測了抗CD44、MAGE、fibronectin、HSP70和EBNA-1的自身抗體。CD44、MAGE、fibronectin和HSP70均能與不同的鼻咽癌患者血清發(fā)生反應(yīng)，這種反應(yīng)強(qiáng)度與正常人血清比較，具有明顯差異(P

11、<0.05)。ELISA分析顯示抗CD44、MAGE、fibronectin和HSP70的自身抗體具有與4個(gè)人噬菌體蛋白良好的親合力，在鼻咽癌患者血清中的水平明顯高于正常人血清和鼻息肉患者血清中的水平(P<0.05)，而在正常人血清和鼻息肉患者血清中的水平無明顯差異(P>0.05)，進(jìn)一步為以抗CD44、MAGE、fibronectin和HSP70的自身抗體作為鼻咽癌的標(biāo)志物提供了依據(jù)。 ROC分析抗CD44、MAGE、fibr

12、onectin和HSP70自身抗體作為鼻咽癌標(biāo)志物的ROC曲線下面積分別為0.7857、0.8922、0.8091和0.84135，而抗EBNA-1自身抗體作為鼻咽癌診斷標(biāo)志物的ROC分析曲線下面積為0.6110，說明抗CD44、MAGE、fibronectin和HSP70的自身抗體作為鼻咽癌診斷的標(biāo)志物，其特異性和敏感性均高于抗EBNA-1自身抗體作為鼻咽癌診斷的標(biāo)志物。 進(jìn)一步分析抗CD44、MAGE、fibronectin

13、和HSP70自身抗體是否可以作為鼻咽癌早期診斷的標(biāo)志物，顯示鼻咽癌患者血清中抗MAGE自身抗體水平與鼻咽癌的臨床分期緊密相關(guān)，抗CD44、fibronectin和HSP70的自身抗體的水平也與鼻咽癌的臨床分期相關(guān)，提示抗MAGE自身抗體可能作為鼻咽癌早期診斷的標(biāo)志物，這些鼻咽癌患者血清自身抗體的水平可以用來預(yù)測鼻咽癌的臨床分期。 總之，通過本研究，證實(shí)了在鼻咽癌患者血清中存在針對鼻咽癌組織的自身抗體，這些自身抗體有可能作為鼻咽癌