細(xì)胞色素b5還原酶2對鼻咽癌細(xì)胞抑制作用的機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)胞色素b5還原酶2(cytochrome b5 reductase2，CYB5R2)含有一個(gè)鐵氧還蛋白還原酶類黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，屬于黃素蛋白的吡啶核苷酸還原酶家族。其參與多種生理反應(yīng)，如電子運(yùn)輸、氧化還原、脂質(zhì)代謝、脂肪酸的去飽和延伸以及紅細(xì)胞中高鐵血紅蛋白的還原反應(yīng)等。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，CYB5R2基因在鼻咽癌中因啟動子區(qū)CpG島DNA高甲基化而轉(zhuǎn)錄失活，外源性表達(dá)CYB5R2可抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移、克隆形成及其在

2、裸鼠體內(nèi)成瘤的能力，但是其抑癌機(jī)制尚未明確。
　　為了進(jìn)一步探索CYB5R2基因在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其抑癌作用的分子機(jī)制，我們通過Human Cancer PathwayFinder PCR Array技術(shù)分析外源性表達(dá)CYB5R2基因?qū)ONE1細(xì)胞中腫瘤相關(guān)的6個(gè)主要通路中的84個(gè)關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，尋找CYB5R2基因抑癌的關(guān)鍵通路。結(jié)果顯示:外源性表達(dá)CYB5R2基因后HONE1細(xì)胞中共有10個(gè)基因顯著差異表達(dá)，

3、其中FAS,CDKN2A，ITGB3，MTSS1和IFNB1基因表達(dá)增高，而ITGB5，VEGF, IGF1，TEK和TGFBR1基因表達(dá)下調(diào)。促凋亡基因FAS的mRNA表達(dá)水平上調(diào)1.81倍;參與細(xì)胞周期控制和DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因CDKN2A的mRNA表達(dá)水平上調(diào)1.57倍;黏附相關(guān)基因如ITGB3，MTSS1的mRNA表達(dá)水平上調(diào)，分別是1.68倍和1.59倍，ITGB5的mRNA水平下調(diào)8.72倍;抗血管生成基因IFNB1的mR

4、NA表達(dá)水平上調(diào)1.84倍;促血管生成基因如VEGF, IGF1，TEK和TGFBR1的mRNA表達(dá)水平下調(diào)，分別是1.69倍、1.57倍、10.28倍和1.71倍。我們對10個(gè)基因的差異表達(dá)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與Human Cancer PathwayFinder PCR Array結(jié)果趨勢一致。
　　我們通過流式細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、Caspase活性檢測實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)、侵襲小室實(shí)驗(yàn)、雞胚絨毛尿囊膜移植瘤模型實(shí)

5、驗(yàn)進(jìn)一步分析了CYB5R2基因參與調(diào)控的下游通路的腫瘤分子生物學(xué)機(jī)制。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染CYB5R2基因的鼻咽癌細(xì)胞比轉(zhuǎn)染空載體的鼻咽癌細(xì)胞株發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)目明顯增多，并且細(xì)胞中Caspase8和Caspase9的活性水平增高。轉(zhuǎn)染CYB5R2基因的鼻咽癌細(xì)胞比轉(zhuǎn)染空載體的鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生周期阻滯的細(xì)胞數(shù)目明顯增多。侵襲小室實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)染CYB5R2基因的鼻咽癌細(xì)胞中發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)目比轉(zhuǎn)染空載體的鼻咽癌細(xì)胞明顯減少。通過雞胚絨毛尿囊膜移

6、植瘤模型實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染CYB5R2基因的鼻咽癌細(xì)胞比轉(zhuǎn)染空載體的鼻咽癌細(xì)胞形成的移植瘤體積明顯減小、移植瘤周圍新生血管所占尿囊膜面積比例明顯下降。分析雞胚移植瘤的組織切片HE染色及免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染CYB5R2基因的鼻咽癌雞胚移植瘤內(nèi)新生血管明顯減少，VEGF的陽性染色明顯減少，說明CYB R2基因能夠抑制鼻咽癌血管生成。
　　綜上所述，CYB5R2可以在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、侵襲轉(zhuǎn)移能力和血管形成能力等多方面抑制鼻咽癌