應(yīng)用RNAi抑制survivin基因誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、肺癌是當(dāng)今世界上發(fā)生率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，盡管采用了手術(shù)、放療和化療等綜合治療措施，但療效不佳。其中一個(gè)重要原因是腫瘤組織抗凋亡相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，癌細(xì)胞凋亡減少，癌細(xì)胞整體耐藥增加。很多研究表明，通過反義核酸技術(shù)抑制腫瘤抗凋亡基因表達(dá)，選擇性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)于有效的清除腫瘤細(xì)胞具有重要意義，是腫瘤基因治療的一項(xiàng)重要策略。然而，誘導(dǎo)凋亡的靶向性差和特異性低是目前限制其療效的兩個(gè)重要因素。選擇腫瘤細(xì)胞特異表達(dá)基因并特異的抑制其表達(dá)，

2、是靶向誘導(dǎo)腫瘤凋亡的關(guān)鍵。RNA干擾(RNAi)技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一種阻抑基因表達(dá)的新方法，它具有高效率、高特異性、顯效快、可以向子代遺傳和可同時(shí)進(jìn)行多基因研究等優(yōu)點(diǎn)，可望作為反義核酸的優(yōu)化方式成為腫瘤基因治療的新手段。Survivin是最近發(fā)現(xiàn)的一種新的IAPS家族蛋白，是迄今發(fā)現(xiàn)的最小的IAPs蛋白，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子。由于其表達(dá)的特異性(僅在人類胚胎組織和腫瘤組織中表達(dá))及對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的雙重作用，使其成為

3、肺癌基因治療研究的理想靶目標(biāo)。因此，通過應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制survivin基因的表達(dá)，觀察分析其對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響，推斷其與肺癌發(fā)生、發(fā)展、治療及預(yù)后的關(guān)系，對(duì)指導(dǎo)肺癌的基因治療有重要意義。 研究目的： 1．研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制survivin基因的表達(dá)對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響，推斷其與肺癌發(fā)生、發(fā)展、治療及預(yù)后的關(guān)系。 2．通過比較幾種特異的小干涉RNA(siRNA)在誘

4、導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的效果，篩選有效的特異的小干涉RNA，獲得針對(duì)肺腺癌細(xì)胞Survivin mRNA和蛋白表達(dá)的最佳siRNA靶序列。 研究內(nèi)容：不同siRNA抑制肺腺癌細(xì)胞survivin表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞凋亡和增殖的影響，篩選有效的特異siRNA，觀察其抑制肺腺癌細(xì)胞survivin mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的效率． 研究方法：根據(jù)survivin編碼框采用生物信息學(xué)，由上海吉瑪制藥有限公司設(shè)計(jì)、合成3組siRNA

5、相關(guān)基因片段和1組FAM標(biāo)記的陰性對(duì)照SiRNA片段，序列經(jīng)BLAST查詢，確定為survivin特異性序列，排除與其他基因同源。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法基因轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，采用MTT (四甲基偶氮唑鹽)比色法分析檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期和凋亡指數(shù)，篩選出特異有效的siRNA進(jìn)行RT-PCR和western blot法觀察其阻斷survivin表達(dá)對(duì)肺腺癌細(xì)胞survivin mRN

6、A和蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制效率． 結(jié)果：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率可以達(dá)到30％左右，熒光倒置顯微鏡下，F(xiàn)AM標(biāo)記的陰性對(duì)照組細(xì)胞呈現(xiàn)黃綠色透亮的細(xì)胞，細(xì)胞碎片增多。MTT法顯示3組siRNA對(duì)A549細(xì)胞增殖有抑制作用，抑制率明顯高于其他組。于轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡，結(jié)果顯示3組siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞明顯被阻滯于G<,2>/M期，3組siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率明顯高于其他3組。結(jié)合MTT法結(jié)果綜合比較3組siRN

7、A，可見siRNA164轉(zhuǎn)染細(xì)胞被阻滯于G<,2>/M期較其它2組更明顯，細(xì)胞凋亡率也比其它2組高，該組siRNA較其它2組對(duì)survivin基因抑制作用更強(qiáng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效果更好，因此選定siRNA164組siRNA繼續(xù)后續(xù)western blot試驗(yàn)和RT-PCR試驗(yàn)．western blot可見siRNA164轉(zhuǎn)染組survivin蛋白表達(dá)下調(diào)，蛋白條帶的灰度低于其余各組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有顯著性。RT-PCR試驗(yàn)顯示siRNA16

8、4組作用于A549細(xì)胞48h后survivin mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，Survivin mRNA表達(dá)的條帶亮度低于其余各組，而空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組和陰性對(duì)照組survivin mRNA水平無明顯變化。 結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了3組針對(duì)survivin基因的siRNA序列，并通過脂質(zhì)體導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞，觀測(cè)其對(duì)細(xì)胞Survivin表達(dá)及細(xì)胞增殖、凋亡的影響。MTT法顯示3組siRNA對(duì)A549細(xì)胞增殖有抑制作用，抑制率明顯高于

9、其他組。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)，3組序列均可以不同程度阻滯A549細(xì)胞于G<,2>/M期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，3組比較可以發(fā)現(xiàn)siRNA 164對(duì)survivin基因的抑制作用更強(qiáng)，成功篩選出siRNA164為最佳序列。RT-PCR及western blot結(jié)果顯示，siRNA轉(zhuǎn)染可顯著抑制Survivin mRNA及蛋白的表達(dá)，證實(shí)了應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制Survivin表達(dá)的可行性。因此，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)survivin構(gòu)建的siRNA，能有效