應(yīng)用SILAC技術(shù)研究藍(lán)萼甲素誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制.pdf

1、背景：以往研究表明藍(lán)萼甲素能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而有關(guān)藍(lán)萼甲素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的詳細(xì)分子機(jī)制至今仍未闡釋清楚。
　　目的：應(yīng)用穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸細(xì)胞培養(yǎng)（stable isotope labeling by amino acid in cell culture，SILAC）定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，探討藍(lán)萼甲素（Glaucocalyxin A）誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
　　方法：藍(lán)萼甲素作

2、用于A549細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化情況，蛋白免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白---多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]剪切條帶（Cleaved PARP）的表達(dá)變化；應(yīng)用SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析藍(lán)萼甲素誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡后細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化，蛋白免疫印跡法驗(yàn)證差異蛋白哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTO

3、R）的表達(dá)情況；蛋白免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白---微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 II型蛋白（microtubule associated protein1 light chain3 II，LC3-II），藍(lán)萼甲素聯(lián)合應(yīng)用3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）作用于A549細(xì)胞后，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的存活率和蛋白免疫印跡法檢測(cè)Cleaved PARP表達(dá)變化情況。
　　結(jié)果：藍(lán)萼甲素作用于人肺腺癌A5

4、49細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡率從5％增加到18%；蛋白免疫印跡結(jié)果表明，Cleaved PARP蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)。定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)藍(lán)萼甲素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后有75個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平上調(diào)，同時(shí)有59個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平下調(diào)；我們從這134個(gè)差異表達(dá)蛋白中選擇了mTOR蛋白進(jìn)行表達(dá)水平驗(yàn)證，蛋白免疫印跡結(jié)果表示：藍(lán)萼甲素細(xì)胞組mTOR蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，這與定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果是一致的；藍(lán)萼甲素細(xì)胞組LC3-II蛋白表達(dá)顯

5、著上調(diào)；聯(lián)合應(yīng)用藍(lán)萼甲素和自噬抑制劑3-MA后，結(jié)果表明，細(xì)胞存活率進(jìn)一步下降，且Cleaved PARP表達(dá)水平進(jìn)一步增加。
　　結(jié)論：鑒定了134個(gè)蛋白在藍(lán)萼甲素誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡過(guò)程中表達(dá)水平發(fā)生了顯著變化，并采用蛋白免疫印跡法證實(shí)了mTOR蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)，該結(jié)果與定量蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)是一致的；并據(jù)此線索通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)萼甲素誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的同時(shí)可激活自噬，這種自噬激活作用對(duì)細(xì)胞存活起著保護(hù)作用。