利用RNAi技術(shù)阻抑hTERT和Bi-1雙基因表達(dá)治療鼻咽癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[目的]
　　 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國華南地區(qū)的高發(fā)性惡性腫瘤，研究表明其發(fā)病除與EB病毒感染、化學(xué)致癌物有關(guān)外，與遺傳易感基因也有密切的關(guān)系。近年來，RNA干擾(RNA interference，RNAi)的研究進(jìn)展非常迅速，這項(xiàng)技術(shù)極有可能用于腫瘤臨床治療。本研究擬從基因治療的角度出發(fā)，首先在細(xì)胞水平上研究以RNAi的方式抑制人鼻咽癌低分化細(xì)胞株CNE-2中人端粒酶末端逆轉(zhuǎn)錄

2、酶(human telomerase reverse transcriplase，hTERT)和Bax抑制因子-1(Bax inhibitor-1，Bi-1)基因的表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響，其次通過建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型從動(dòng)物整體水平研究以RNAi方式抑制上述兩個(gè)靶基因后基因表達(dá)的變化和對(duì)腫瘤生長的影響，從而探討治療鼻咽癌的新策略。
　　 [方法]
　　 首先，用以前篩選構(gòu)建的重組質(zhì)粒：即以pcDNA3.1(+)為載

3、體構(gòu)建的含T7啟動(dòng)子的shRNA真核表達(dá)載體shRNA-TR、shRNA-Bi-1、shRNA-TR-Bi-1和各自的陰性對(duì)照載體，hTERT和Bi-1基因的最佳干擾靶點(diǎn)為(hTERT，gi：AF015950，2474～2492位；Bi-1，gi：23271944，738～760位)。用LipofectamineTM2000(Lip)將各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2內(nèi)，并用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)轉(zhuǎn)染率；用MTT法觀察干擾載體及

4、轉(zhuǎn)染試劑對(duì)CNE-2細(xì)胞生長增殖的影響；測(cè)量Caspase-3活性并結(jié)合FCM來檢測(cè)細(xì)胞凋亡；用Real-Time PCR法檢測(cè)shRNA重組質(zhì)粒對(duì)hTERT和Bi-1基因表達(dá)的抑制效果；用Western-blot觀察抑制相關(guān)基因后其蛋白質(zhì)表達(dá)的變化；采用Hoechst33258染色，并用熒光顯微鏡觀察鼻咽癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化；用細(xì)胞創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移能力的變化；用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞克隆形成能力。
　　 其次，建立鼻

5、咽癌裸鼠移植瘤模型；用上述重組質(zhì)粒與Lip的混合物瘤內(nèi)注射后測(cè)量腫瘤體積及計(jì)算腫瘤生長抑制率，繪制生長曲線；用HE染色觀察瘤組織病理改變；用Real-time PCR法檢測(cè)各重組質(zhì)粒作用瘤組織后hTERT和Bi-1基因mRNA表達(dá)情況；用免疫組化檢測(cè)各重組質(zhì)粒作用瘤組織后hTERT和Bi-1蛋白的表達(dá)情況；并用TUNEL法檢查腫瘤組織細(xì)胞凋亡。
　　 [結(jié)果]
　　 體外水平結(jié)果：Lip對(duì)質(zhì)粒pEGFP-N1的轉(zhuǎn)染率為6

6、6.26％。分別轉(zhuǎn)染7種shRNA的重組質(zhì)粒(pcDNA3.1(+)、shRNA-TR、shRNA-TRs、shRNA-Bi-1、shRNA-Bi-1s、shRNA-TR-Bi-1、shRNA-TR-Bi-1s)后，shRNA-TR、shRNA-Bi-1和shRNA-TR-Bi-1組的CNE-2細(xì)胞生長增殖能力降低，其中shRNA-TR-Bi-1組的生長增殖能力最低(P<0.01)；轉(zhuǎn)染shRNA-TR、shRNA-Bi-1和shRNA

7、-TR-Bi-1重組質(zhì)粒后，熒光顯微鏡下可見部分鼻咽癌細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化；與未處理組相比，shRNA-TR、shRNA-Bi-1和shRNA-TR-Bi-1組中hTERT和Bi-1的mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.01)且蛋白的表達(dá)也相應(yīng)減弱。細(xì)胞的遷移能力、克隆形成能力均有所降低，其中以shRNA-TR-Bi-1組更明顯(P<0.05)。
　　 體內(nèi)觀察結(jié)果：成功建立鼻咽癌移植瘤模型：與未處理組、Lip組和pcDN

8、A3.1(+)相比，用各重組質(zhì)粒與脂質(zhì)體的復(fù)合物治療后，shRNA-TR、shRNA-Bi-1和shRNA-TR-Bi-1組的瘤體積增長減慢，瘤組織出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象及病理性改變，以shRNA-TR-Bi-1組更明顯；shRNA-TR、shRNA-Bi-1和shRNA-TR-Bi-1組中瘤組織hTERT和Bi-1的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01)且蛋白表達(dá)也相應(yīng)減弱。
　　 [結(jié)論]
　　 Lip介導(dǎo)靶向作用人hT