利用RNAi阻抑Bax inhibitor-1（bi-1）基因表達并誘導人鼻咽癌細胞凋亡的研究.pdf

1、【目的】 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國華南地區(qū)的高發(fā)性惡性腫瘤，研究表明其發(fā)病除與EB病毒感染、化學致癌物有關外，與遺傳易感基因也有密切的關系。近年來，RNA干擾(RNA interference,RNAi)的研究進展非常迅速，這項技術極有可能用于腫瘤臨床治療。本課題擬從基因治療的角度，以進化保守的凋亡抑制基因bi-1為靶點，針對bi-1基因設計并構建表達shRNA的質粒載體，利用Li

2、pofectaminea<'TM>2000(Lip)有效地將其轉染至鼻咽癌細胞內，誘導序列特異性的基因沉默，旨在研究RNAi效應對人鼻咽癌低分化細胞株CNE-2Z和高分化細胞株CNE-1 bi-1基因表達的抑制作用及其對細胞增殖抑制和凋亡誘導作用，探討鼻咽癌新的治療策略。 【方法】 根據(jù)人bi-1基因序列及二級結構特征，借助網上siRNA設計工具，尋找bi-1基因編碼序列(CDS)中4個可能的干擾位點(長度為27nt)，

3、經BLAST確定與其它基因不存在同源性。人工合成5對正反義脫氧寡核苷酸鏈，退火、定向克隆入含小鼠U6(mU6)啟動子的真核表達質粒載體pmU6中，構建表達shRNA的系列重組質粒載體，研究其產生的shRNA抑制bi-1基因表達的效果，并觀察其誘導鼻咽癌細胞凋亡的情況。瓊脂糖凝膠電泳法初步篩選正確的重組克隆，DNA測序驗證重組克隆的正確性；流式細胞術(FCM)檢測轉染率；MTT 法觀察質粒載體及轉染試劑對CNE-2Z 和 CNE-1 生長

4、增殖的影響；FCM 檢測細胞凋亡；RT-PCR法分析表達shRNA重組質粒載體對bi-1基因mRNA表達的抑制效應，通過上述實驗從4條27nt siRNA 候選序列中篩選出1條活性高、特異性強的序列。以篩選出的27nt siRNA序列為基礎，設計相應的19、23、29nt siRNA序列，構建相應的重組質粒并進行DNA測序鑒定。MTT 法檢測重組質粒載體對鼻咽癌細胞生長增殖的抑制效應；Hoechst33258/PI 雙染色熒光顯微鏡觀察

5、鼻咽癌細胞形態(tài)學的變化；FCM和DNA ladder檢測細胞凋亡；RT-PCR、Westem-blot分析重組質粒載體對有關基因mRNA和蛋白質表達的抑制效果 【結果】 DNA測序結果證實各重組質粒(含 27nt siRNA)的插入轉錄模板完全正確。Lip 對質粒的轉染率為 50％～60％。分別轉染5種含 27nt siRNA 的重組質粒后，CNE-2Z和CNE-1 細胞的生長增殖能力降低；bi-1，mRNA 水平有不同

6、程度的下調；凋亡細胞有所增加。與其它重組質粒比較，pmU6-bi-1-4 質粒的干擾效果顯著，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 與pmU6-bi1-19和pmU6-bi-1-23重組質粒相比，pmU6-bi-1-29和pmU6-bi-1-27質粒在抑制細胞生長增殖和誘導凋亡等方面效果明顯，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。轉染 pmU6-bi-1-29重組質粒48h后，熒光顯微鏡下可見部分鼻咽癌細胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學

7、變化；DNA 凝膠電泳圖譜出現(xiàn)“梯狀”條帶；可明顯下調bi-1、bel-2、bcl-xL、survivin的mRNA和蛋白表達水平；面caspase-3、-12的mRNA水平上調，蛋白水平下調：未處理組細胞中上述基因的mRNA和蛋白水平均無明顯變化。 【結論】 成功構建了針對人bi-1基因的shRNA真核表達質粒。構建的重組質粒能特異、有效地阻抑bi-1基因表達，但其不能使bi-1基因完全沉默，且不同的siRNA序列下調

8、bi-1基因表達的效率不同：比較具有相同長度的siRNA序列，位于基因尾部的位點干擾效果較好；針對同一位點設計不同長度的siRNA序列，當長度<30nt 時，較長的siRNA序列具有較好的干擾效果。表達針對bi-1 shRNA的重組質?？娠@著下調bi-1基因mRNA和蛋白表達水平并可誘導人鼻咽癌細胞凋亡。在阻抑bi-1基因表達，誘導人鼻咽癌細胞凋亡的過程中，bel-2、bel-xL、survivin、caspase-3、-12的表達也發(fā)