抑癌基因PDCD4在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究目的
　　 動(dòng)脈粥樣硬化癥是脂質(zhì)代謝異常導(dǎo)致的動(dòng)脈血管壁的慢性炎癥性疾病，是心絞痛、急性心肌梗死或猝死等急性冠狀動(dòng)脈綜合征的主要病理基礎(chǔ)，已經(jīng)成為嚴(yán)重影響我國(guó)中老年人健康的常見(jiàn)疾病，并有逐年遞增的趨勢(shì)。盡管動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但是最近幾年來(lái)有關(guān)“動(dòng)脈粥樣硬化是動(dòng)脈血管壁慢性炎性疾病”的炎癥學(xué)說(shuō)得到了大家的認(rèn)可，積累的證據(jù)顯示許多炎癥因子和免疫細(xì)胞參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，即動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生是血管壁細(xì)胞與血液

2、細(xì)胞在多種炎癥因子和致病因子作用下相互作用所導(dǎo)致的一種血管損傷過(guò)程。在這一過(guò)程中，單核/巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的固有免疫反應(yīng)和T細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)均發(fā)揮重要作用。
　　 抑癌基因是一類控制細(xì)胞過(guò)度增殖并遏制腫瘤形成的基因。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，很多抑癌基因例如P53，PTEN等不僅與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，而且參與了免疫反應(yīng)和炎性疾病等生理和病理過(guò)程。程序性細(xì)胞死亡-4(programmedcelldeath4，PDCD4)是新確定的一種抑

3、癌基因，在人多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的抑制作用，但在炎性疾病中的作用尚不明確。有限的幾篇報(bào)道顯示PDCD4基因敲除(Pdcd4-/-)小鼠可抵抗自身免疫性疾病——實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎(EAE)和Ⅰ型糖尿病的發(fā)生及脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的內(nèi)毒素性休克，提示PDCD4不僅具有抑癌基因的作用，很可能在炎癥性疾病中也發(fā)揮重要作用。那么，PDCD4是否在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮作用呢？發(fā)揮何種作用？其作用機(jī)制是什么？目前尚不清楚。<

4、br>　　 為了明確PDCD4在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用，探索其作用機(jī)制，為動(dòng)脈粥樣硬化的臨床治療提供理論證據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，本論文從以下兩個(gè)方面進(jìn)行了研究:一、PDCD4在動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中的表達(dá)及作用:我們發(fā)現(xiàn)隨著Apoe-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展PDCD4在斑塊局部的表達(dá)逐漸升高，提示PDCD4參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。進(jìn)一步采用雙基因敲除（Pdcd4-/-Apoe-/-）小鼠證明PDCD4的缺失明顯減少斑塊的形成，說(shuō)明內(nèi)源性P

5、DCD4在動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮促進(jìn)作用。并且發(fā)現(xiàn)PDCD4的缺失影響了T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在斑塊局部的浸潤(rùn)。二、PDCD4對(duì)免疫細(xì)胞的影響及其在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用:首先通過(guò)骨髓移植實(shí)驗(yàn)證明免疫細(xì)胞在PDCD4影響動(dòng)脈粥樣硬化的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。然后體內(nèi)外試驗(yàn)比較Pdcd4-/-Apoe-/-與Apoe-/-小鼠斑塊局部及外周的巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞及其各亞群的比例，并檢測(cè)了其分泌細(xì)胞因子的改變。我們發(fā)現(xiàn)PDCD4的缺失顯著升高了IL-10的

6、水平，進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)PDCD4缺失導(dǎo)致的IL-10的升高是斑塊減少的一個(gè)重要原因。最后我們用RIP實(shí)驗(yàn)確定了PDCD4不是通過(guò)直接與IL-10mRNA結(jié)合從而在翻譯水平抑制其表達(dá)，而是通過(guò)ERK和P38通路在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控IL-10的表達(dá)。
　　 研究方法
　　 一、PDCD4在動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中的表達(dá)及作用
　　 1.PDCD4在動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中的表達(dá)
　　 (1)用Westernblot的

7、方法檢測(cè)8周齡未高脂、高脂8周（16周齡）和高脂16周（24周齡）的Apoe-/-小鼠血管斑塊局部蛋白中PDCD4的表達(dá)情況。
　　 (2)用免疫組化的方法對(duì)斑塊局部PDCD4的表達(dá)進(jìn)行細(xì)胞定位。
　　 2.PDCD4在動(dòng)脈粥樣硬化形成中的作用
　　 (1)將Pdcd4-/-小鼠與Apoe-/-小鼠雜交獲得雙基因敲除小鼠(Pdcd4-/-Apoe-/-)做為實(shí)驗(yàn)組，Apoe-/-小鼠做為對(duì)照組，給予高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)斑

8、塊的形成。
　　 (2)高脂喂養(yǎng)8周或16周后，取主動(dòng)脈根制備冰凍切片，HE、油紅O染色及免疫組織化學(xué)染色比較Pdcd4-/-Apoe-/-和Apoe-/-小鼠主動(dòng)脈根部斑塊大小、脂質(zhì)沉積、組成成分（平滑肌和膠原）及炎性浸潤(rùn)（T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）的差別;取主動(dòng)脈弓及胸腹主動(dòng)脈，經(jīng)油紅O染色后，解剖顯微鏡下觀察并比較大體解剖斑塊數(shù)量和面積的差別。
　　 二、PDCD4對(duì)免疫細(xì)胞的影響及其在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用:
　　

9、 1.骨髓移植實(shí)驗(yàn)證明免疫細(xì)胞在PDCD4缺失導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化減弱過(guò)程中發(fā)揮主要作用
　　 (1)分別收集Pdcd4-/-和C57BL/6小鼠股骨和脛骨中骨髓細(xì)胞，通過(guò)尾靜脈注射移植入受致死劑量X射線照射的Ldlr-/-小鼠體內(nèi)，高脂喂養(yǎng)12周和16周后，分別處死小鼠，主動(dòng)脈根部制備冰凍切片，HE和油紅O染色觀察并比較斑塊的大小。
　　 (2)冰凍切片進(jìn)行免疫組化染色比較巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞在斑塊局部的浸潤(rùn)情況。
　　

10、 (3)Westernblot的方法檢測(cè)骨髓移植后高脂喂養(yǎng)2周、12周和16周的Ldlr-/-小鼠血管斑塊中PDCD4的表達(dá)。
　　 2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究PDCD4缺失對(duì)巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞亞群的影響
　　 (1)Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠和Apoe-/-小鼠高脂喂養(yǎng)8周或16周后，研磨小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè)并比較巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞各亞群(CD4+，CD8+，Th17，Treg)比例的變

11、化，并用直線回歸的方法分析其比例與斑塊面積大小的相關(guān)性。
　　 (2)冰凍切片免疫熒光或免疫組化染色比較斑塊局部CD4+和CD8+比例的變化。
　　 3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究PDCD4缺失對(duì)巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的影響
　　 (1)血清中:流式細(xì)胞微球芯片試劑盒和ELISA的方法檢測(cè)并比較Pdcd4-/-Apoe-/-和Apoe-/-小鼠高脂喂養(yǎng)后血清中細(xì)胞因子(IL-2，IL-4，IL-6，IFN-γ，TNF-α

12、，IL-17，IL-10，TGF-β）的改變，并用直線回歸的方法分析細(xì)胞因子濃度與斑塊面積大小之間的相關(guān)性。
　　 (2)斑塊局部:
　　 1)冰凍切片免疫雙熒光染色比較斑塊局部IL-17和IL-10水平的變化。
　　 2)將含有大量斑塊的主動(dòng)脈弓及胸腹主動(dòng)脈血管組織裂解提取RNA或蛋白，分別用realtimePCR或Westernblot的方法檢測(cè)并比較斑塊局部細(xì)胞因子的改變。
　　 4.體外實(shí)驗(yàn)研究P

13、DCD4對(duì)T細(xì)胞功能的影響及其機(jī)制
　　 (1)對(duì)T細(xì)胞增殖能力的影響:
　　 1)體外培養(yǎng)脾細(xì)胞并刺激活化，CCK8試劑盒檢測(cè)并比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的增殖情況。
　　 2)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖情況。
　　 3)流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)CD4+和CD8+T細(xì)胞中協(xié)同刺激分子CD28、CD137和協(xié)同抑制分子CTLA-4比例的變化。
　　 (2)對(duì)T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響:流式細(xì)胞微

14、球芯片試劑盒檢測(cè)并比較培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的改變。
　　 5.體外實(shí)驗(yàn)研究PDCD4對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響:收集Pdcd4-/-和C57BL/6小鼠腹腔巨噬細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，并用氧化低密度脂蛋白(oxLDL)刺激不同的時(shí)間段使其活化，ELISA的方法檢測(cè)并比較培養(yǎng)上清中促炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-α和抑炎性細(xì)胞因子IL-10的濃度。
　　 6.體內(nèi)干預(yù)治療確定IL-17和IL-10在PDCD4缺失減弱動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成

15、過(guò)程中的作用:以Apoe-/-小鼠做正常對(duì)照，將Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠分為三組，高脂喂養(yǎng)4周后分別給予生理鹽水、重組IL-17細(xì)胞因子和IL-10中和性抗體腹腔注射一周一次，共注射5周，處死小鼠，主動(dòng)脈根部制備冰凍切片，HE和油紅O染色觀察并比較斑塊的大小。
　　 7.分子機(jī)制研究探討PDCD4從翻譯水平還是轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控IL-10的表達(dá)
　　 (1)RNA蛋白結(jié)合免疫沉淀試劑盒(RIP)獲得與PDCD4結(jié)合的

16、全部RNA，realtimePCR擴(kuò)增IL-10，確定PDCD4是否與IL-10mRNA形成復(fù)合體從而確定PDCD4是否從翻譯水平調(diào)控IL-10的表達(dá)。
　　 (2)提取活化巨噬細(xì)胞的總RNA，用RT-PCR的方法檢測(cè)并比較IL-10在mRNA水平的表達(dá)。
　　 (3)提取活化巨噬細(xì)胞的蛋白，用Westernblot的方法檢測(cè)并比較MAPK(JNK,ERK1/2，P38)信號(hào)通路的活化情況，并通過(guò)加入信號(hào)通路抑制劑后EL

17、ISA檢測(cè)上清中IL-10的表達(dá)情況確定PDCD4通過(guò)哪條信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)控IL-10的轉(zhuǎn)錄。
　　 結(jié)果
　　 一、PDCD4在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成過(guò)程中的表達(dá)與作用
　　 1.動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型的建立
　　 我們給予8周齡的Apoe-/-小鼠高脂飼料喂養(yǎng)，造成體內(nèi)高血脂壞境，誘導(dǎo)斑塊的形成。分別取8周齡（未高脂）做為無(wú)斑塊期，16周齡（高脂8周）做為早期斑塊期和24周齡（高脂16周）做為晚期斑塊期。<

18、br>　　 2.PDCD4在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成過(guò)程中的表達(dá)
　　 為了明確PDCD4在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過(guò)程中的表達(dá)情況，我們分離16周和24周Apoe-/-小鼠富含斑塊的主動(dòng)脈弓及胸腹主動(dòng)脈裂解蛋白，以8周齡無(wú)斑塊血管為對(duì)照，westernblot的方法檢測(cè)了PDCD4的表達(dá)情況，結(jié)果顯示隨著高脂喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)（即動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展）PDCD4的表達(dá)明顯升高。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)PDCD4主要表達(dá)于免疫細(xì)胞（巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞

19、），另外，在平滑肌細(xì)胞中也有表達(dá)，提示PDCD4可能具有促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和發(fā)展的作用。
　　 3.PDCD4在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成過(guò)程中的作用
　　 為了研究PDCD4在動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中的作用，我們制各了Pdcd4和Aope雙基因敲除(Pdcd4-/-Apoe-/-)小鼠，并以此小鼠為實(shí)驗(yàn)組，以Apoe-/-小鼠為對(duì)照組，研究了PDCD4缺失對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)8周或16周后Pdcd4

20、-/-Apoe-/-小鼠主動(dòng)脈根部的斑塊和主動(dòng)脈弓及胸腹主動(dòng)脈段的斑塊較對(duì)照組相比，面積均明顯減小(p＜0.01)，脂質(zhì)沉積減少(p＜0.01)，局部巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞的浸潤(rùn)都較對(duì)照組明顯減少(p＜0.05)。另外，膠原含量、平滑肌細(xì)胞也明顯減少(p＜0.01)。以上結(jié)果說(shuō)明PDCD4缺失使動(dòng)脈粥樣硬化斑塊減小，即PDCD4本身起促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的作用。
　　 二、PDCD4對(duì)免疫細(xì)胞功能的影響及其在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用:

21、r>　　 1.骨髓移植實(shí)驗(yàn)證明免疫細(xì)胞在PDCD4缺失導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化減弱的過(guò)程中發(fā)揮主要作用
　　 已知免疫細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而且PDCD4在斑塊局部浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞中高表達(dá)，PDCD4缺失的小鼠斑塊局部巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞浸潤(rùn)減少，提示PDCD4可能通過(guò)改變免疫細(xì)胞的功能發(fā)揮作用，故我們進(jìn)一步利用骨髓移植的方法論證這個(gè)問(wèn)題。我們將C57BL/6(含有野生型PDCD4)和Pdcd4-/-（缺失P

22、DCD4）小鼠的骨髓細(xì)胞移植給Ldlr-/-小鼠，并通過(guò)高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)斑塊的形成。然后取主動(dòng)脈根制備冰凍切片進(jìn)行HE和油紅O染色，比較斑塊面積的大小，發(fā)現(xiàn)移植Pdcd4-/-骨髓細(xì)胞的Ldlr-/-小鼠斑塊面積明顯比移植C57BL/6骨髓細(xì)胞的斑塊減小(p＜0.05)。將主動(dòng)脈弓和胸腹主動(dòng)脈段在解剖顯微鏡下剖開(kāi)，油紅O染色，發(fā)現(xiàn)移植Pdcd4-/-骨髓細(xì)胞的Ldlr-/-小鼠大體解剖斑塊面積明顯比移植C57BL/6骨髓細(xì)胞的斑塊數(shù)量減少，

23、面積減小(p＜0.01)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)移植Pdcd4-/-骨髓細(xì)胞的Ldlr-/-小鼠巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞的浸潤(rùn)較對(duì)照組明顯減輕。我們還用westernblot的方法檢測(cè)了移植后小鼠血管斑塊中PDCD4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)移植Pdcd4-/-骨髓細(xì)胞的Ldlr-/-小鼠斑塊中PDCD4表達(dá)較弱，明顯比對(duì)照組減少，所以我們認(rèn)為斑塊中PDCD4雖在平滑肌細(xì)胞中有所表達(dá)，但其主要表達(dá)于免疫細(xì)胞中。以上結(jié)果雖不能排除平滑肌細(xì)胞的作用，但可證明免疫細(xì)胞在PDCD

24、4缺失減弱動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的過(guò)程中發(fā)揮著主要作用。
　　 2.體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PDCD4缺失導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞降低而Treg升高
　　 為了進(jìn)一步研究PDCD4對(duì)免疫細(xì)胞的影響，我們用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了外周免疫器官——脾臟中巨噬細(xì)胞(F4/80+)和T細(xì)胞各亞群(CD4+，CD8+，Treg)數(shù)量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDCD4缺失后小鼠脾臟巨噬細(xì)胞比例無(wú)明顯差別，但是CD8+T細(xì)胞比例在高脂喂養(yǎng)8周和16周后Pdcd4-/-Apo

25、e-/-小鼠較對(duì)照組都明顯降低(p＜0.01)，CD4+T細(xì)胞比例呈降低趨勢(shì)，其中CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)比例明顯上升(p＜0.01)，而效應(yīng)性Th1、Th2和Th17細(xì)胞無(wú)明顯變化。直線回歸分析顯示CD8+T細(xì)胞數(shù)量與斑塊面積呈正相關(guān)，而Treg數(shù)量與斑塊面積呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。進(jìn)一步斑塊局部免疫細(xì)胞化學(xué)染色證明Pdcd4-/-Aope-/-小鼠斑塊局部CD8+T細(xì)胞數(shù)量占斑塊面積的比例較對(duì)照組明顯減少(p＜0.01)，

26、而Treg(Foxp3+)細(xì)胞數(shù)量占斑塊面積的比例則比對(duì)照組明顯升高(p＜0.05)，變化趨勢(shì)與外周一致。已知CD8+T細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化的形成過(guò)程中起促進(jìn)作用，而Treg起抑制作用，我們的結(jié)果說(shuō)明PDCD4缺失導(dǎo)致的CD8+T細(xì)胞降低和Treg升高可能是斑塊減少的原因之一。
　　 3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PDCD4缺失導(dǎo)致抑炎性細(xì)胞因子IL-10增加而促炎性細(xì)胞因子IL-17下降
　　 為了研究PDCD4對(duì)外周巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞

27、相關(guān)細(xì)胞因子的影響，我們?nèi)「咧桂B(yǎng)16周的Pdcd4-/-Apoe-/-和Apoe-/-小鼠血清，流式細(xì)胞微球芯片試劑盒和ELISA的方法分析了多種細(xì)胞因子（IL-2，IL-4，IL-6，IFN-γ，TNF-α，IL-17，IL-10和TGF-β）的變化，結(jié)果顯示Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠血清中IL-10、IL-6和IFN-γ濃度較對(duì)照組升高(p＜0.05)，而IL-17和TGF-β濃度較對(duì)照組降低(p＜0.05)，其他細(xì)胞因子

28、無(wú)明顯改變。為了確定細(xì)胞因子的變化與斑塊減小的關(guān)系，我們進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)促炎性細(xì)胞因子IL-17的濃度與斑塊面積呈正相關(guān)，而抑炎性細(xì)胞因子IL-10濃度與斑塊的面積呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而IL-6、IFN-γ和TGF-β的濃度與斑塊的大小沒(méi)有明顯的相關(guān)關(guān)系。
　　 為了進(jìn)一步確定PDCD4缺失對(duì)細(xì)胞因子的影響及與斑塊形成的關(guān)系，我們采用realtimePCR、Westernblot、免疫組織化學(xué)和免疫熒光等方法檢測(cè)了斑塊局部細(xì)胞因

29、子的改變，發(fā)現(xiàn)IL-17和IL-10的表達(dá)與外周趨勢(shì)一致，Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠斑塊局部IL-17明顯低于對(duì)照組(p＜0.05)，而IL-10明顯高于對(duì)照組(p＜0.01)。與外周不同的是，IL-6在Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠斑塊局部mRNA水平較對(duì)照組降低(p＜0.05)，而TGF-β較對(duì)照組升高(p＜0.001)，其他細(xì)胞因子沒(méi)有明顯差別。已知IL-6和IL-17是促炎性細(xì)胞因子，具有促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的作

30、用;而IL-10和TGF-β是抑炎性細(xì)胞因子，具有抑制斑塊形成的作用。故PDCD4缺失導(dǎo)致的細(xì)胞因子譜的改變可能是PDCD4缺失導(dǎo)致斑塊減少的另一個(gè)機(jī)制。
　　 4.體外實(shí)驗(yàn)研究PDCD4對(duì)T細(xì)胞功能的影響及其機(jī)制
　　 (1)PDCD4缺失導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞增殖能力降低
　　 明確了PDCD4對(duì)T細(xì)胞亞群數(shù)量的影響，為了進(jìn)一步明確其對(duì)T細(xì)胞功能的影響，我們?nèi)?6周Pdcd4-/-Apoe-/-和Apoe-/-小

31、鼠的脾臟，制備脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸液進(jìn)行體外培養(yǎng)，并用CD3抗體刺激T細(xì)胞活化。然后用CCK8試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)3天后T細(xì)胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠脾細(xì)胞增殖能力較對(duì)照組明顯減弱(p＜0.001)，而用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+和CD8+T細(xì)胞亞群比例發(fā)現(xiàn)，CD4+T細(xì)胞增殖情況無(wú)明顯差別，而Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠CD8+T細(xì)胞增殖后比例較對(duì)照組明顯減少(p＜0.05)，說(shuō)明PDCD4缺失降低了CD8+T細(xì)胞的

32、增殖能力。
　　 因?yàn)門細(xì)胞的活化增殖除了抗原提供第一信號(hào)外，必須通過(guò)協(xié)同刺激分子傳遞第二信號(hào)，所以為了明確CD8+T細(xì)胞增殖能力的減弱是否由于協(xié)同刺激分子表達(dá)的改變所致，我們用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了CD4+和CD8+T細(xì)胞協(xié)同刺激分子（CD28和CD137）和協(xié)同抑制分子(CTLA-4)的表達(dá)，結(jié)果顯示提供活化信號(hào)的CD28和CD137在CD4+T細(xì)胞上的表達(dá)兩種小鼠無(wú)明顯差別，而在CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)Pdcd4-/-Apoe-/

33、-小鼠較對(duì)照組均明顯下降(p＜0.05);提供抑制信號(hào)的CTLA-4在CD4+和CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)均較對(duì)照組升高(p＜0.05)。以上結(jié)果提示，Pdcd4缺失引起的CD8+T細(xì)胞增殖能力及數(shù)量的降低可能由于CD8+T細(xì)胞上協(xié)同刺激分子CD28和CD137表達(dá)下調(diào)，而協(xié)同抑制分子CTLA-4表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致的。
　　 (2)PDCD4缺失導(dǎo)致T細(xì)胞分泌IL-17減少
　　 我們用流式細(xì)胞微球芯片試劑盒檢測(cè)T細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)

34、胞因子的分泌情況，發(fā)現(xiàn)Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠T細(xì)胞分泌的IL-17較對(duì)照組明顯下降(p＜0.05)，而其他細(xì)胞因子均無(wú)明顯差別，這與之前血清中IL-17濃度的改變趨勢(shì)是一致的，提示IL-17濃度的降低可能是PDCD4缺失減弱動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的原因之一。
　　 5.體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PDCD4缺失導(dǎo)致巨噬細(xì)胞產(chǎn)生高水平的IL-10
　　 我們進(jìn)一步在體外研究了PDCD4對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響，收集C57BL/6和Pdc

35、d4-/-小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)，并用oxLDL模擬體內(nèi)高脂環(huán)境刺激其活化。分別取刺激6、12、24和48h培養(yǎng)上清，ELISA的方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β的濃度，結(jié)果顯示，除了TGF-β在兩種小鼠中無(wú)明顯差別之外，其余3種細(xì)胞因子均為Pdcd4-/-小鼠較對(duì)照組升高，但是IL-6和TNF-α濃度在12h達(dá)到高峰以后，隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，而IL-10濃度隨時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)增加，所以IL-1

36、0的抑炎作用可能占主導(dǎo)地位。
　　 6.體內(nèi)干預(yù)治療確定IL-10的上調(diào)是PDCD4缺失導(dǎo)致斑塊減少的主要原因
　　 在我們前期實(shí)驗(yàn)研究中，給Apoe-/-小鼠注射重組細(xì)胞因子IL-17可以明顯加重斑塊的發(fā)展。為了探討PDCD4缺失引起的IL-17下降和IL-10增多是否是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊減小的主要原因，我們采用同樣的處理方法，將Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠分為3組，分別在高脂喂養(yǎng)5周后腹腔注射生理鹽水、重組IL-

37、17細(xì)胞因子和IL-10中和性抗體，每周一次，共注射5周，并以Apoe-/-小鼠注射生理鹽水做為正常對(duì)照。主動(dòng)脈根部制備冰凍切片，HE和油紅O染色比較斑塊的大小，結(jié)果顯示注射IL-17組較注射生理鹽水組斑塊面積無(wú)明顯差異，而注射IL-10中和性抗體組較生理鹽水組斑塊面積明顯增加(p＜0.05)。以上結(jié)果提示，PDCD4缺失引起的IL-10增多是其減弱動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的主要機(jī)制。
　　 7.分子機(jī)制研究證明PDCD4主要在轉(zhuǎn)錄水平

38、發(fā)揮對(duì)IL-10的負(fù)調(diào)控作用
　　 為了探討PDCD4是否在翻譯水平調(diào)控IL-10的表達(dá)，首先采用RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RNA-BindingProteinImmunoprecipitation，RIP）的方法檢測(cè)活化的巨噬細(xì)胞中PDCD4是否與具有5'UTR二級(jí)結(jié)構(gòu)的IL-10mRNA形成復(fù)合體從而抑制IL-10的翻譯，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDCD4與IL-10mRNA不結(jié)合，即PDCD4不影響IL-10的翻譯，故我們認(rèn)為PDCD4是從

39、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控IL-10的表達(dá)。
　　 然后，我們從mRNA水平研究PDCD4對(duì)IL-10表達(dá)的調(diào)控。分別取刺激3、6和12h的巨噬細(xì)胞提取其RNA，用RT-PCR的方法檢測(cè)IL-10在mRNA水平的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Pdcd4-/-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-10在mRNA水平上的表達(dá)明顯較對(duì)照組升高，提示PDCD4在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)IL-10的表達(dá)。為了明確PDCD4的缺失通過(guò)改變了哪條信號(hào)傳導(dǎo)通路從而增加了IL-10的轉(zhuǎn)錄，我們用western

40、blot的方法檢測(cè)了分別刺激6、12和24h的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-10的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)通路（MAPK通路）分子的表達(dá)情況，結(jié)果顯示磷酸化活化的JNK在兩種小鼠中無(wú)明顯差別，而ERK1/2和P38的磷酸化活化在Pdcd4-/-小鼠中較對(duì)照組明顯升高。為了明確這兩條通路的作用，我們?cè)诖碳ぞ奘杉?xì)胞活化的同時(shí)分別添加ERK1/2和P38抑制劑，結(jié)果IL-10產(chǎn)生明顯下降。以上結(jié)果提示Pdcd4缺失可能通過(guò)增加ERK1/2和P38的磷酸化活化從而導(dǎo)致IL

41、-10的產(chǎn)生增加。
　　 結(jié)論
　　 1.PDCD4在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和發(fā)展過(guò)程中表達(dá)上調(diào)。
　　 2.Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠斑塊面積減小，斑塊局部巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞浸潤(rùn)減少。
　　 3.通過(guò)骨髓移植實(shí)驗(yàn)證實(shí)了免疫細(xì)胞在PDCD4缺失減弱動(dòng)脈粥樣硬化的過(guò)程中起主要作用。
　　 4.外周和斑塊局部CD8+T細(xì)胞比例減少，而Treg比例升高;促炎性細(xì)胞因子IL-17濃度降低，而抑炎性細(xì)胞

42、因子IL-10濃度增加。
　　 5.PDCD4缺失CD8+T細(xì)胞增殖能力下降，可能是通過(guò)下調(diào)協(xié)同刺激分子CD28和CD137，而上調(diào)協(xié)同抑制分子CTLA-4實(shí)現(xiàn)的。
　　 6.PDCD4缺失巨噬細(xì)胞分泌IL-10增加。
　　 7.體內(nèi)試驗(yàn)證明IL-10增加是PDCD4缺失后斑塊減小的主要原因。
　　 8.PDCD4不影響IL-10的翻譯，可能是通過(guò)ERK和P38通路從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控IL-10的表達(dá)。

43、　　 創(chuàng)新性和研究的意義
　　 1.首次證明抑癌基因PDCD4具有促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的作用:我們發(fā)現(xiàn)Apoe-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)展過(guò)程中PDCD4表達(dá)上調(diào)，Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積減小。本研究為以PDCD4為靶點(diǎn)臨床治療動(dòng)脈粥樣硬化提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)根據(jù)。
　　 2.通過(guò)骨髓移植實(shí)驗(yàn)確定了免疫細(xì)胞在PDCD4影響動(dòng)脈粥樣硬化中的作用。首次提出PDCD4可引起巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞亞群

44、數(shù)量和功能的改變。
　　 3.我們通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)證明了PDCD4缺失導(dǎo)致的IL-10增加是Pdcd4敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊減弱的主要原因。發(fā)現(xiàn)PDCD4不影響IL-10的翻譯水平，而是通過(guò)ERK和P38通路從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控IL-10的表達(dá);此研究不僅明確了PDCD4影響動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制，而且為動(dòng)脈粥樣硬化的治療提供了新的靶點(diǎn)。局限性
　　 1.由于技術(shù)的限制，本論文僅使用敲基因小鼠做為研究對(duì)象，沒(méi)有在PDCD4過(guò)表達(dá)