Pdcd4對脂肪來源干細胞的調控及其在飲食誘導肥胖中的作用.pdf

1、本文分為兩個部分進行探討：
　　第一部分 Pdcd4對脂肪來源干細胞的調控及其在飲食誘導肥胖中的作用
　　目的：
　　分別將來自WT和Pdcd4-/-小鼠的ADSC進行體外培養(yǎng)，檢測兩種來源的ADSC在干性標志、增殖能力和成脂分化等方面的不同，并進一步探討其內在機制;同時利用動物體內實驗對相關結論進行了驗證。
　　方法：
　　一、 Pdcd4缺失對ADSC干細胞相關標志的影響
　　1.ADSC的提取和

2、培養(yǎng)
　　分離WT和Pdcd4-/-小鼠附睪處脂肪組織，剪碎后加入相應體積的膠原酶，37℃搖床45 min后觀察消化情況并終止消化，過濾離心即得到含有ADSC的基質血管成分（Stromal vascular fraction，SVF）。用培養(yǎng)基重懸細胞，接種至6孔板中進行培養(yǎng)擴增。每2-3天換液一次，待細胞融合度達到90％左右時進行傳代。
　　2.ADSC表面干細胞相關標志檢測
　　通過流式細胞術的方法，分別檢測WT和

3、Pdcd4-/-ADSC表面陽性標志CD105、CD90和陰性標志CD11b、CD11c的表達情況。
　　3.Pdcd4缺失對ADSC干性標志的影響
　　分別提取WT和Pdcd4-/-ADSC和SVF中總RNA，檢測RNA濃度并進行逆轉錄，通過Real-time PCR的方法來檢測干性標志Nanog、 Oct4和Sox2的表達。
　　二、Pdcd4缺失對ADSC自我更新能力的影響
　　1.Pdcd4缺失對ADSC

4、增殖能力的影響
　　體外實驗:首先通過CCK-8實驗檢測WT和Pdcd4-/-ADSC在培養(yǎng)12 h和24 h后細胞增殖能力的不同，通過克隆形成實驗檢測其克隆形成能力的差異。接下來又通過EdU摻入和PI染色檢測細胞的增殖及周期變化。
　　體內實驗:將EdU通過腹腔注射到WT和Pdcd4-/-小鼠體內，24h后取附睪處脂肪組織，固定包埋切片并進行染色，觀察脂肪組織中ADSC的增殖情況。
　　2.Pdcd4缺失對ADSC增

5、殖相關信號通路的影響
　　取處于對數(shù)生長期的WT和Pdcd4-/-ADSC，用Western-blot的方法檢測p-AKT和細胞周期蛋白cyclinD1的表達情況。為了進一步驗證AKT通路在ADSC增殖過程中的影響，我們在細胞培養(yǎng)過程中加入2μM AKT抑制劑MK2206，用Western-blot和EdU摻入的方法檢測加入抑制劑之后細胞增殖的變化。
　　結果：
　　一、Pdcd4缺失增強ADSC干細胞相關標志的表達<

6、br>　　1.Pdcd4缺失增強ADSC表面標志的表達
　　檢測WT和Pdcd4-/-ADSC在體外培養(yǎng)擴增后干細胞相關表型的表達。對兩種不同來源的ADSC進行拍照觀察，兩種細胞在形態(tài)上并沒有明顯的差異。WT和Pdcd4-/-ADSC都高表達干細胞相關的表面標志CD105和CD90，不表達或者低表達CD11b和CD11c。不同的是，與WT ADSC相比，Pdcd4-/-ADSC表面CD105和CD90的表達水平明顯增高。
　

7、　2.Pdcd4缺失增強ADSC干性相關標志的表達
　　接下來，我們檢測了干細胞干性相關基因Nanog、 Oct4和Sox2在mRNA水平的變化。與WTADSC相比，Pdcd4-/-ADSC中Nanog、 Oct4在mRNA水平的表達明顯上調，而Sox2變化不是很明顯。為了排除體外擴增培養(yǎng)對ADSC的可能影響，我們又檢測了ND小鼠SVF中干性相關基因的表達。結果顯示，Pdcd4-/-小鼠SVF中Nanog、 Oct4和Sox2的表

8、達在mRNA水平的表達都較WT小鼠SVF中顯著增高。
　　二、Pdcd4缺失增強ADSC的自我更新能力
　　1.Pdcd4缺失促進ADSC由G1期進入到S期，進而促進ADSC的增殖
　　從CCK-8方法繪制的生長曲線和克隆形成實驗的結果都可以看出Pdcd4缺失能夠促進ADSC的增殖。而EdU染色的結果提示Pdcd4-/-ADSC有較多的細胞處于細胞周期的S期，流式細胞術檢測細胞周期的結果顯示與WTADSC相比，Pdcd

9、4-/-ADSC處于S期的細胞比例增大，而處于G1期的細胞數(shù)明顯減少。WAT石蠟切片的EdU染色結果顯示，Pdcd4-/-WAT中有較多的細胞處于增殖期。提示Pdcd4缺失可以增強小鼠WAT中ADSC的干性。以上結果表明Pdcd4缺失能夠促進ADSC由G1期進入到S期，進而促進ADSC的增殖。
　　2.Pdcd4缺失引起的ADSC周期變化依賴于AKT信號通路的激活
　　利用Western-blot的方法檢測WT和Pdcd4-

10、/-ADSC中AKT的活化狀態(tài)，結果顯示與WT ADSC相比，Pdcd4-/-ADSC中p-AKT的水平明顯上調，cyclinD1表達也顯著增強。加入AKT抑制劑MK2206后，WT ADSC的細胞增殖受到了明顯的抑制，EdU陽性的細胞數(shù)也明顯降低，但cyclinD1的變化不大。然而在Pdcd4-/-ADSC中，AKT的抑制伴隨著cyclinD1表達的顯著下調，EdU陽性的細胞數(shù)也大大降低。以上結果表明Pdcd4缺失引起的ADSC由G1

11、期向S期的轉換依賴于AKT信號通路的激活。
　　結論：
　　1.Pdcd4缺失增強ADSC的干性。
　　2.Pdcd4缺失通過激活AKT通路促進ADSC的G1/S期轉換，進而促進其增殖。
　　3.Pdcd4缺失促進ADSC由白色脂肪細胞轉分化為米色脂肪細胞。
　　第二部分 Pdcd4在氧化低密度脂蛋白和高脂飲食誘導應激顆粒形成中的作用研究
　　目的：
　　檢測了高脂飲食條件下Pdcd4對巨噬細胞

12、和肝組織中SG形成的影響，并進一步用ox-LDL刺激巨噬細胞、HeLa細胞和HepG2細胞，觀察在體外誘導條件下Pdcd4對SG形成的影響，并探討其內在機制。
　　方法：
　　1.高脂小鼠巨噬細胞和肝組織中SG的檢測
　　首先用野生型(Wild type，WT)和Pdcd4-/-雄性小鼠建立飲食誘導肥胖模型，取高脂飲食WT和Pdcd4-/-小鼠腹腔巨噬細胞和肝組織的石蠟切片進行TIA-1的免疫熒光染色，觀察TIA-1+

13、SG的形成。
　　2.Pdcd4在SG形成中的作用
　　分別提取WT和Pdcd4-/-小鼠腹腔巨噬細胞，設置ox-LDL刺激組和對照組，進行TIA-1的免疫熒光染色，觀察SG的形成情況，并對含有SG的細胞數(shù)進行統(tǒng)計學分析。
　　3.Pdcd4與SG的定位關系
　　Ox-LDL分別刺激WT巨噬細胞和轉染了pEGFP-C1-Pdcd4質粒的HeLa細胞，24 h后進行SG特異性標志TIA-1、FXR1和eIF4A的免

14、疫熒光染色，觀察Pdcd4與SG標志的定位關系。
　　結果：
　　1.高脂喂養(yǎng)Pdcd4-/-小鼠中巨噬細胞和肝組織中的SG減少
　　首先，我們以TIA-1作為應激顆粒的標志，檢測WT和Pdcd4-/-小鼠腹腔巨噬細胞和肝組織中SG的形成。結果顯示，WT巨噬細胞中可以明顯得觀察到TIA-1+ SG，而Pdcd4-/-巨噬細胞中則很少，肝組織中也出現(xiàn)類似的現(xiàn)象。這些數(shù)據表明，SG能夠參與高脂飲食誘導的應激反應，更重要的是

15、揭示在高脂飲食的刺激下，Pdcd4是SG形成的一個關鍵因素。
　　2.Pdcd4缺失能夠降低ox-LDL刺激的巨噬細胞中TIA-1+ SG的形成
　　我們用ox-LDL刺激分別刺激WT和Pdcd4-/-巨噬細胞，結果顯示WT巨噬細胞中含TIA-1+SG的細胞數(shù)顯著升高，而Pdcd4-/-巨噬細胞中含TIA-1+SG的細胞數(shù)變化并不明顯，只有很少的細胞中可觀察到SG。與WT巨噬細胞相比，Pdcd4-/-巨噬細胞中含有TIA-1

16、+SG的細胞數(shù)明顯下降。以上結果說明，Pdcd4缺失能夠降低ox-LDL刺激的巨噬細胞中TIA-1+SG形成。
　　3.Ox-LDL刺激的巨噬細胞中Pdcd4與SG特異性標志的共定位
　　免疫熒光的結果顯示，在ox-LDL刺激的WT巨噬細胞中Pdcd4與SG特異性標志TIA-1、FXR1和eIF4A的表達具有良好的共定位關系，說明ox-LDL可以誘導巨噬細胞中SG的產生，Pdcd4可能是SG的一個重要組成部分。
　　結