脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)及其在飲食誘導(dǎo)肥胖中的作用.pdf

1、研究背景和目的
　　肥胖是由于能量攝入大于消耗導(dǎo)致脂肪在體內(nèi)過度堆積而形成的一種慢性代謝性疾病。眾所周知，肥胖可以誘發(fā)胰島素抵抗、高血糖、高血壓、高血脂等一系列代謝綜合征，并進(jìn)一步導(dǎo)致Ⅱ型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病甚至癌癥的發(fā)生。近年來，由于飲食結(jié)構(gòu)以及生活方式的改變，肥胖在全世界的發(fā)病率逐年升高，已經(jīng)發(fā)展為嚴(yán)重影響人類健康的疾病。因此針對(duì)肥胖的干預(yù)治療是預(yù)防和治療肥胖相關(guān)疾病的重要措施。
　　巨噬細(xì)胞是脂肪組織中的重

2、要免疫細(xì)胞。目前認(rèn)為巨噬細(xì)胞可分為兩種亞型，一種是經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞，介導(dǎo)炎癥反應(yīng);另一種是選擇性活化的M2型巨噬細(xì)胞，具有抑制炎癥的作用。有研究證實(shí)，正常的腹內(nèi)白色脂肪組織中以M2巨噬細(xì)胞為主，參與維持脂肪組織的免疫穩(wěn)態(tài);而隨著肥胖的發(fā)生，白色脂肪組織中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞則以M1巨噬細(xì)胞為主，介導(dǎo)脂肪組織炎癥的發(fā)生發(fā)展。由于脂肪組織炎癥是胰島素抵抗和代謝綜合征發(fā)生的關(guān)鍵因素，因此調(diào)控巨噬細(xì)胞的活化是抑制脂肪組織炎癥、控制肥胖相關(guān)代謝

3、紊亂的重要措施。
　　脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cell，ADSC)，是存在于脂肪組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)，具有多向分化潛能，是目前組織修復(fù)和再生領(lǐng)域的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。我們的前期工作中證實(shí)，ADSC可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2方向極化，進(jìn)而抑制肥胖誘發(fā)的脂肪組織炎癥，增強(qiáng)肥胖小鼠對(duì)胰島素的敏感性。但ADSC影響巨噬細(xì)胞向M2型極化的機(jī)制尚不清楚。

4、r>　　外泌體(exosome)是由細(xì)胞分泌的直徑約在30-150nm大小的囊泡樣結(jié)構(gòu)小體，內(nèi)含有多種具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)和RNA，參與細(xì)胞之間信息的交流與傳遞。因來源的細(xì)胞不同，外泌體的成分和功能也有所不同。有研究證實(shí)，外泌體不但可以作為腫瘤等疾病的生物學(xué)診斷標(biāo)志物，在疾病的治療中也起到重要作用。MSC因在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)中起重要作用，故針對(duì)MSC來源外泌體的研究也得到了大家的廣泛關(guān)注。但針對(duì)ADSC來源外泌體的研究少有涉及，而ADSC

5、來源外泌體對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)以及在飲食誘導(dǎo)肥胖中的作用尚無研究。
　　為了明確ADSC來源外泌體在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞以及飲食誘導(dǎo)肥胖中的作用，我們進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)研究，通過高脂飲食喂養(yǎng)建立小鼠肥胖模型，并用ADSC來源外泌體對(duì)肥胖模型小鼠進(jìn)行干預(yù)，證實(shí)了ADSC來源外泌體可以抑制高脂飲食小鼠的脂肪組織炎癥和代謝紊亂，并減緩其肥胖的進(jìn)展;此外，我們的研究亦證實(shí)ADSC來源外泌體可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2方向極化，進(jìn)而抑制肥胖相關(guān)脂肪組織炎癥并

6、延緩肥胖的進(jìn)展。這為肥胖的干預(yù)治療提供了新的思路與方向。
　　方法：
　　一、ADSC的分離擴(kuò)增和培養(yǎng)
　　取10-12周齡的C57BL/6雄性小鼠的附睪處脂肪組織，將組織剪碎后加入Ⅰ型膠原酶，37℃搖床中消化45分鐘。過濾離心后，把得到的血管基質(zhì)成分（stromal vascular fraction，SVF）接種到六孔板中進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，24小時(shí)后換液以去除懸浮細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80％融合度時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞傳代。傳代后梭

7、形的貼壁細(xì)胞即為ADSC。取第四代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　二、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的獲取
　　取6-8周齡的C57BL/6雄性小鼠，腹腔注射1ml6％無菌淀粉溶液，72小時(shí)后麻醉后處死小鼠，用無血清的DMEM培養(yǎng)基灌洗腹腔，收集腹腔灌洗液，過濾離心后，用含有10％血清的培養(yǎng)基重懸巨噬細(xì)胞，計(jì)數(shù)，接種于12孔板或者6孔板中，過夜培養(yǎng)后可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　三、ADSC來源外泌體的提取與鑒定
　　用去除外泌體的培養(yǎng)基培養(yǎng)

8、ADSC，取第四代ADSC的培養(yǎng)上清，過濾離心后，取上室濃縮液于新的無菌的15ml離心管中，加入Exoquick-TCTM外泌體提取試劑提取外泌體，無菌PBS重懸沉淀并分裝，-80℃冷凍保存。
　　將提取的外泌體分別用納米粒度分析儀、透射電鏡的方法對(duì)其大小以及形態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，用Western-blot的方法檢測(cè)外泌體標(biāo)志TSG101、CD9、CD63、HSP90的表達(dá)。
　　四、體外研究ADSC來源外泌體對(duì)巨噬細(xì)胞的影響

9、>　　ADSC來源外泌體與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞共孵育，用熒光定量PCR的方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞M1相關(guān)表型誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素12（interleukin-12，IL-12），以及M2相關(guān)表型精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1）、白介素10(interleukin-10，IL-

10、10)的mRNA表達(dá)水平。Western-blot檢測(cè)Arg-1的表達(dá)變化。
　　用LPS和IFN-γ聯(lián)合刺激經(jīng)外泌體孵育過的巨噬細(xì)胞，用熒光定量PCR的方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞中iNOS、TNF-α、IL-12的mRNA表達(dá)水平。用ELISA的方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞中炎性因子TNF-α、IL-12的蛋白表達(dá)水平。
　　五、小鼠肥胖模型的建立及ADSC來源外泌體干預(yù)治療
　　C57BL/6雄性小鼠在8周齡時(shí)給予60％高脂飼料喂養(yǎng)20

11、-26周，以建立飲食誘導(dǎo)肥胖模型，對(duì)照組小鼠采用常規(guī)飼料喂養(yǎng)。在高脂飲食喂養(yǎng)末期，對(duì)小鼠進(jìn)行為期6-8周的外泌體干預(yù)治療（腹腔注射，30μg/小鼠，每3天注射一次）。
　　六、ADSC來源外泌體干預(yù)對(duì)小鼠肥胖的影響
　　在高脂飲食喂養(yǎng)期間，每周對(duì)各組實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行稱重，并于外泌體干預(yù)期間監(jiān)測(cè)小鼠攝食量的變化。外泌體干預(yù)結(jié)束后，稱量各組小鼠的體重，觀察外泌體干預(yù)治療對(duì)肥胖小鼠體重的影響。麻醉后處死小鼠，取其附睪處白色脂肪組織、皮

12、下白色脂肪組織以及棕色脂肪組織進(jìn)行稱重，計(jì)算各部位脂肪組織重量占體重的百分比，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　七、ADSC來源外泌體干預(yù)對(duì)小鼠代謝參數(shù)的影響
　　ADSC來源外泌體治療過程中或治療后，分別對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(glucose tolerance test，GTT)、胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(insulin glucose tolerance test，ITT)檢測(cè)，以及檢測(cè)血清中甘油三酯(triglyceride，TG)

13、和總膽固醇(totalcholesterol，TC)的變化。
　　八、ADSC來源外泌體干預(yù)對(duì)小鼠白色脂肪組織米色化的影響
　　外泌體干預(yù)結(jié)束后，取小鼠附睪處以及皮下脂肪組織，Trizol法抽提RNA后，用熒光定量PCR的方法檢測(cè)棕色脂肪UCP1、PGC1α，米色脂肪標(biāo)志TBX1、TMEM26的mRNA水平的表達(dá)。Western-blot的方法檢測(cè)UCP1在蛋白水平的表達(dá)。
　　九、ADSC來源外泌體干預(yù)對(duì)脂肪組織炎癥

14、及巨噬細(xì)胞活化的影響
　　取小鼠附睪處白色脂肪組織，ELISA檢測(cè)附睪處脂肪組織塊培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-10的表達(dá);熒光定量PCR檢測(cè)小鼠附睪處白色脂肪組織SVF中TNF-α、IL-6、IL-12等的表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠附睪處白色脂肪組織SVF中F4/80、Arg-1的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　一、ADSC來源外泌體促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化
　　將ADSC來源外泌體作用于小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，熒光定量PCR結(jié)

15、果顯示，外泌體刺激顯著上調(diào)巨噬細(xì)胞M2相關(guān)表型Arg-1、IL-10的mRNA表達(dá)水平，而其M1相關(guān)表型iNOS、TNF-α、IL-12的mRNA表達(dá)水平則無明顯變化。Western-blot結(jié)果顯示，外泌體孵育后巨噬細(xì)胞中Arg-1的蛋白表達(dá)水平明顯升高。此外，將經(jīng)外泌體孵育的巨噬細(xì)胞用LPS和IFN-γ進(jìn)行聯(lián)合刺激，發(fā)現(xiàn)外泌體孵育的巨噬細(xì)胞對(duì)LPS和IFN-γ刺激的反應(yīng)性明顯降低，其iNOS、TNF-α和IL-12的表達(dá)水平較未經(jīng)外

16、泌體孵育的巨噬細(xì)胞有顯著下調(diào)。以上結(jié)果提示ADSC來源外泌體可促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2極化，進(jìn)而抵抗LPS和IFN-γ誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。
　　二、ADSC來源外泌體抑制肥胖小鼠的體重增加
　　將高脂喂養(yǎng)的肥胖模型小鼠分為外泌體干預(yù)組(HFD-exosome)和生理鹽水組(HFD-NS)，以常規(guī)飲食喂養(yǎng)的小鼠注射生理鹽水作為對(duì)照組(NCD-NS)。外泌體干預(yù)結(jié)束后，對(duì)小鼠體重及其小鼠附睪處白色脂肪組織、皮下白色脂肪組織、棕色脂

17、肪組織稱重發(fā)現(xiàn)，高脂喂養(yǎng)導(dǎo)致小鼠體重及白色脂肪組織重量明顯增加，而外泌體干預(yù)治療后，小鼠的體重以及各個(gè)部位的白色脂肪組織重量較HFD-NS組均明顯下降。
　　三、ADSC來源外泌體改善高脂喂養(yǎng)小鼠的代謝紊亂
　　GTT和ITT結(jié)果顯示，相對(duì)于HFD-NS組的小鼠，HFD-exosome組小鼠對(duì)葡萄糖的耐受性和對(duì)胰島素的敏感性都有明顯的改善，且在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。試劑盒檢測(cè)血清中甘油三酯和膽固醇的水平發(fā)現(xiàn)，高脂飲食

18、喂養(yǎng)后，肥胖小鼠血清中甘油三酯和膽固醇的水平明顯上調(diào)，而外泌體干預(yù)治療后血清甘油三酯和膽固醇的水平則明顯下調(diào)。
　　四、ADSC來源外泌體促進(jìn)高脂喂養(yǎng)小鼠的白色脂肪米色化
　　外泌體干預(yù)結(jié)束后，取小鼠附睪處以及皮下白色脂肪組織進(jìn)行熒光定量PCR。結(jié)果顯示，HFD-exosome組中附睪處和皮下白色脂肪組織中棕色及米色脂肪細(xì)胞標(biāo)志基因UCP1、PGC1α、TBX1、TMEM26的表達(dá)量較HFD-NS組均有不同程度的升高。Wes

19、tern-blot結(jié)果顯示，與HFD-NS組相比，HFD-exosome組小鼠的附睪處以及皮下白色脂肪組織中UCP1的蛋白水平明顯升高。由此可以看出，ADSC來源外泌體可以促進(jìn)高脂喂養(yǎng)小鼠的白色脂肪米色化。
　　五、ADSC來源外泌體促進(jìn)白色脂肪組織中巨噬細(xì)胞的M2極化并抑制白色脂肪組織炎癥
　　附睪處白色脂肪組織的體外培養(yǎng)結(jié)果顯示，外泌體干預(yù)治療后，小鼠附睪處白色脂肪組織分泌的促炎細(xì)胞因子TNF-α較HFD-NS組明顯降低

20、，而抑炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)水平則明顯升高。同時(shí)，熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，高脂喂養(yǎng)的肥胖小鼠附睪處白色脂肪組織SVF中TNF-α、IL-12和IL-6的mRNA水平較NCD-NS組均有不同程度的升高，而外泌體干預(yù)則可顯著降低以上炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。相反，外泌體干預(yù)治療可明顯上調(diào)高脂喂養(yǎng)小鼠SVF中M2相關(guān)Arg-1的mRNA水平。流式結(jié)果亦顯示，外泌體干預(yù)治療可明顯上調(diào)高脂喂養(yǎng)小鼠白色脂肪組織中巨噬細(xì)胞的Arg-1表達(dá)水平。以上