PDCD4在脂多糖-d-半乳糖胺誘導的小鼠急性肝損傷中的作用研究.pdf

1、目的：
　　 程序性死亡因子4，PDCD4(programmedcelldeath4，PDCD4)是近年來發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，現(xiàn)已證實它可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控多種基因的表達，抑制腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移。我們的前期研究結果已經(jīng)證實PDCD4在卵巢癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)展中發(fā)揮了非常重要的作用，然而，最近一些研究顯示PDCD4在許多炎癥性疾病中也發(fā)揮了重要的作用。已有報道，PDCD4基因敲除（Pdcd-/-4）小鼠抵抗I型糖尿病及實驗性自

2、身免疫性腦脊髓膜炎(EAE)的發(fā)生，并且可以降低脂多糖(lipopolysacchrides，LPS)誘導的小鼠死亡率。上述結果提示PDCD4是一個促炎蛋白。然而，另外有報道指出，PDCD4敲除的RAW264.7巨噬細胞系經(jīng)LPS刺激后可以產(chǎn)生更多的促炎因子TNF-α，這提示PDCD4是一個抗炎因子。因此，PDCD4在炎癥中的作用目前仍不清晰。
　　 由腸源性內(nèi)毒素導致的急性肝損傷是臨床上常見的肝功能衰竭和患者死亡的原因之一。內(nèi)

3、毒素是革蘭氏陰性菌的細胞壁成分—LPS，它可以強有力地激活枯否細胞和內(nèi)皮細胞，具有廣泛的生物學效應。LPS刺激枯否細胞使其產(chǎn)生并分泌炎性細胞因子如:TNF-α、IL-1β、IL-6等，其分泌依賴于MAPK和NF-κB信號通路的激活。這些炎性因子，特別是TNF-α，可以誘導肝細胞的凋亡和壞死。在這個過程中，枯否細胞受LPS刺激后激活，在炎癥反應中扮演了重要的角色，而肝細胞是主要的靶細胞。D-半乳糖胺作為一種氨基糖，可以誘導體內(nèi)UTP的消耗

4、從而增強LPS的肝臟毒性。利用LPS聯(lián)合D-半乳糖胺(LPS/D-GalN)給小鼠進行腹腔注射，可以誘導特異性的肝損傷產(chǎn)生，而對心、脾、肺等其他器官未造成明顯損傷。因此，LPS/D-GalN誘導的急性肝損傷模型是目前研究內(nèi)毒素導致的肝損傷的理想動物模型。
　　 本實驗的目的是研究PDCD4在LPS/D-GalN誘導的小鼠急性肝損傷中的作用，并對其機制進行進一步探討。通過本研究的完成，不僅有利于闡明PDCD4在炎癥中的調(diào)控作用，而

5、且為揭示內(nèi)毒素誘導急性肝損傷的發(fā)病機制、尋找新的靶點奠定了堅實的基礎。
　　 方法：
　　 一、PDCD4基因缺失后對急性肝損傷的影響
　　 以Pdcd-/-4小鼠為實驗組，以同系且同齡的野生型C57BL/6小鼠為對照組，采用50μg/kgLPS及800mg/kgD-GalN腹腔注射建立內(nèi)毒素性急性肝損傷動物模型。分別在建模后0小時、3小時、5小時獲得血清和肝臟標本進行以下各指標的檢測。
　　 1.觀察實

6、驗組和對照組小鼠肝臟大體觀，檢測兩組小鼠肝重和體重的比值變化。
　　 2.利用全自動生化分析儀檢測兩組小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的含量。
　　 3.利用HE染色做病理學檢測，并利用破碎DNA的原位末端標記技術(TUNEL)試劑盒檢測凋亡肝細胞的百分數(shù)。
　　 4.利用免疫組化染色（immunohistochemistry，IHC）及westernblot檢測兩組小鼠肝組織中caspase

7、-3的表達情況。
　　 二、PDCD4基因缺失后對小鼠體內(nèi)炎性因子水平的影響
　　 1.利用BD流式細胞因子微球組合試劑盒檢測實驗組和對照組小鼠血清中炎性細胞因子TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-10、IL-12p70的含量，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清中IL-1β的含量。
　　 2.利用RT-PCR的方法檢測肝組織中各種炎性因子(Tnfa、Il1b、Il6、Mcp1、Il10、Il12p40

8、、Il12p35)mRNA的水平。
　　 三、PDCD4基因缺失后對炎癥信號通路活化的影響
　　 1.利用westernblot的方法檢測兩組小鼠肝組織中炎癥信號通路MAPK的活化情況。
　　 2.利用westernblot和IHC的方法檢測兩組小鼠肝組織中炎癥信號通路NF-κB的活化情況。
　　 四、體外檢測PDCD4基因缺失后對小鼠腹腔巨噬細胞的影響
　　 分離Pdcd-/-4小鼠及同系且同齡

9、的野生型C57BL/6小鼠的腹腔巨噬細胞，在體外利用LPS刺激，分別在刺激后0小時、3小時、5小時收集其培養(yǎng)上清和巨噬細胞蛋白進行以下各指標的檢測。
　　 1.利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測培養(yǎng)上清中TNF-α及IL-6的含量。
　　 2.利用westernblot的方法檢測兩組小鼠腹腔巨噬細胞中兩條主要的炎癥信號通路MAPK和NF-κB的活化情況。
　　 結果：
　　 一、在脂多糖/D-半乳糖胺

10、誘導的急性肝損傷中PDCD4的缺失加重肝細胞的凋亡和壞死程度
　　 1.肝臟大體形態(tài)顯示與對照組小鼠相比，建模后5小時，Pdcd-/-小鼠肝臟腫脹更為明顯，并呈現(xiàn)紫黑色，肝臟與體重的比值明顯高于對照組小鼠;
　　 2.建模后5小時，Pdcd-/-4小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量顯著高于對照組小鼠;
　　 3.建模后5小時，H&E染色結果顯示與對照組小鼠相比，Pdc-/-4小鼠的肝組織小葉

11、正常結構消失，出現(xiàn)片狀出血壞死及炎性細胞浸潤;
　　 4.肝組織切片的TUNEL染色顯示，誘導肝損傷后5小時，Pdcd-/-4小鼠肝臟細胞TUNEL陽性細胞數(shù)量顯著高于對照組小鼠。肝組織切片caspase-3免疫組化染色和肝組織蛋白westernblot結果進一步顯示，建模后5小時，Pdc-/-4小鼠肝組織caspase-3活化程度顯著高于對照組小鼠。
　　 二、在脂多糖/D-半乳糖胺誘導的急性肝損傷中PDCD4的缺失導

12、致血清及肝臟局部某些炎性細胞因子的水平增加
　　 1.建模后3小時，Pdcd-/-4小鼠血清中炎性因子TNF-α、IL-6、MCP-1水平顯著高于對照組小鼠;
　　 2.建模后3小時，Pdcd-/-4小鼠肝臟組織中Tnfa，Il1b，Il6和Mcp1mRNA水平顯著高于對照組小鼠。
　　 三、PDCD4的缺失促進LPS誘導的肝臟內(nèi)MAPK和NF-κB通路的活化
　　 1.建模后3小時，Pdcd-/-4小鼠

13、肝臟組織中p-JNK的水平顯著高于對照組小鼠，建模后5小時，Pdcd-/-4小鼠肝臟組織中p-ERK、p-P38水平都顯著高于對照組小鼠;
　　 2.建模后3小時和5小時，Pdcd-/-4小鼠肝臟組織中p-P65的水平顯著高于對照組小鼠。
　　 四、PDCD4基因缺失后增強LPS誘導的腹腔巨噬細胞活化
　　 1.在LPS刺激3小時和5小時后，Pdcd-/-4小鼠的腹腔巨噬細胞上清中TNF-α顯著高于對照組小鼠，在

14、LPS刺激5小時后，Pdcd-/-4小鼠的腹腔巨噬細胞上清中IL-6顯著高于對照組小鼠。
　　 2.LPS刺激3小時后，Pdcd-/-4小鼠的巨噬細胞中磷酸化的P38，ERK表達顯著增加，LPS刺激5小時后，Pdcd-/-4小鼠的巨噬細胞中磷酸化的JNK表達顯著增加;
　　 3.LPS刺激3小時和5小時后，Pdcd-/-4小鼠巨噬細胞中磷酸化的P65水平明顯高于對照組小鼠。
　　 結論及意義：
　　 以上