抗菌肽對D-氨基半乳糖聯(lián)合內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠急性肝衰竭保護作用的研究.pdf

1、研究背景及目的:肝衰竭是由多種因素引起的肝臟合成、解毒、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生嚴重障礙,導(dǎo)致肝臟功能嚴重失代償,出現(xiàn)以黃疸、凝血機制障礙、肝性腦病以及腹水等為主要表現(xiàn)的一組臨床癥候群。肝衰竭發(fā)病急、進展快、并發(fā)癥多、預(yù)后差、死亡率高。目前,盡管原位肝臟移植和人工肝支持治療可作為肝功能衰竭治療的有效手段,但前者供體肝缺乏,且存在手術(shù)復(fù)雜、術(shù)后可能發(fā)生排斥反應(yīng)等缺點,使得這一治療措施難以廣泛推廣;后者也面臨血漿來源緊張,對晚期肝功能衰竭治

2、療效果差等問題。尋找新的肝衰竭治療手段勢在必行。以腸源性內(nèi)毒素血癥為核心的繼發(fā)性肝臟損傷是導(dǎo)致肝衰竭病情迅速進展的重要原因。因此,探尋以中和內(nèi)毒素為目標(biāo)的治療手段。以阻斷肝衰竭患者內(nèi)毒素血癥導(dǎo)致的繼發(fā)打擊成為目前肝衰竭研究的熱點。
　　陽離子抗菌肽(cationicantimicrobial peptides,AMPs)是一類帶凈正電荷的兩性小分子多肽,在生物體內(nèi)廣泛存在。研究發(fā)現(xiàn),AMPs具有強大的中和內(nèi)毒素的能力,并因此抑制炎

3、癥因子的釋放。基于此,本研究通過體外實驗及小鼠肝衰竭動物模型探討AMPs治療肝衰竭的可行性。
　　方法:我們首先在體外研究不同AMPs中和內(nèi)毒素的效率,用鱟試驗(LAL assay)檢測四種AMPs(PY、Ts、LL-37、Th)中和內(nèi)毒素作用;采用CCK-8法檢測四種AMPs對RAW264.7的毒性作用;用體外溶血實驗評價四種AMPs的溶血活性;流式細胞技術(shù)檢測AMPs對肝細胞凋亡率的影響;構(gòu)建D-氨基半乳糖聯(lián)合內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠急

4、性肝衰竭模型,觀察AMPs對模型小鼠存活率的影響,觀察各組肝臟病理學(xué)變化,并通過免疫組化、Western blot檢測其肝組織中凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達。
　　結(jié)果:1.中和內(nèi)毒素作用:PY、Ts、LL-37、Th均有較強的中和內(nèi)毒素作用,并且有一定的劑量關(guān)系,隨著AMPs濃度的升高,中和率也明顯升高;PY及LL-37有更強的中和能力;進一步組間比較,四種AMPs不同濃度間存在差異(P<0.05),且四種AMPs分別在

5、1、10、100umol/L中任意一個濃度比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　2.細胞毒性研究:Ts、Th均有微弱的細胞毒性,且沒有呈現(xiàn)明顯的劑量關(guān)系。LL-37有一定的劑量關(guān)系,只有在相對較高的濃度(>100umol/L)才表現(xiàn)明顯的細胞毒性。PY對細胞的毒性有明顯地劑量依賴性,在高濃度(>40umol/L)時,有較強的細胞毒性,而在低濃度時只有較弱的細胞毒性。在濃度低于10umol/L時,四組均有較高的細胞存活率。

6、進一步組間比較,PY、Ts、LL-37、Th不同濃度間存在差異,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且隨著濃度的降低,AMPs的細胞毒性逐步降低;四種AMPs在任意一個濃度比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.溶血活性研究:四種AMPs濃度低于40umol/L時,均表現(xiàn)輕微的溶血活性,在相對較高的濃度(80umol/L),PY、Th、Ts仍表現(xiàn)微弱的溶血活性,而LL-37則表現(xiàn)明顯的溶血活性,進一步組間比較,四種AM

7、Ps在不同濃度間存在差異,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且隨著濃度的降低,AMPs的溶血活性逐步降低;四種AMPs分別在任意一個濃度比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　4.對小鼠原代肝細胞凋亡的保護作用:與陽性對照組相比,四種AMPs均對肝細胞凋亡有抑制作用,其中PY的抑制作用最為明顯;四種AMPs分別與陽性對照組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);相同濃度四種AMPs對細胞凋亡的抑制能力為:PY>LL-3

8、7>Ts>Th;Ts、Th、LL-37的細胞凋亡率均為在80umol/L時更低;而PY在40umol/L時細胞凋亡率更低。
　　5.小鼠肝衰竭模型存活率的研究:PY、Ts、LL-37、Th對肝衰竭模型小鼠存活率有一定影響,且存在劑量關(guān)系;中等劑量的PY、LL-37(PY3、LL-373)小鼠的存活率較高;Ts、Th在1.5-6mg/kg范圍內(nèi),隨劑量升高,存活率升高。
　　6.組織學(xué)檢測:HE染色:各組AMPs分別與對照組比

9、較,肝組織損傷程度:PY1.5>對照組>PY6>PY3;免疫組化法檢測肝組織Caspase-3(激活型)表達顯示:Caspase-3在正常肝組織不表達或少量表達,對照組表達明顯升高;Caspase-3表達程度:PY1.5>對照組>PY6>PY3>正常組。
　　7. Western blot:Caspase-3表達面積灰度比值為:PY1.5>對照組>PY6>PY3>正常組;組間兩兩比較,正常組、PY3、PY6分別與對照組之間存在差異

10、,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05);PY1.5與PY3、PY6之間存在差異,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。
　　結(jié)論:
　　本文通過體外實驗比較PY、Ts、LL-37、Th四種AMPs中和內(nèi)毒素作用、細胞毒性、溶血活性及對LPS誘導(dǎo)小鼠原代肝細胞凋亡的抑制作用,發(fā)現(xiàn)PY具有中和內(nèi)毒素能力強且毒副作用低等優(yōu)勢。進一步研究PY對D-氨基半乳糖聯(lián)合內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠急性肝衰竭模型的保護作用,發(fā)現(xiàn)特定劑量PY可以顯著改善肝衰竭小