脂肪來源干細胞對肥胖相關炎癥及胰島素抵抗的作用及機制研究.pdf

1、背景及目的:
　　擬通過體內(nèi)外實驗，研究ADSC對于肥胖相關炎癥及胰島素抵抗的作用。我們通過建立肥胖模型，并對模型小鼠進行ADSC干預治療，證實了ADSC能夠緩解肥胖誘發(fā)的慢性炎癥以及胰島素抵抗;并且通過體內(nèi)外實驗證明了ADSC通過促進巨噬細胞向抑炎M2型轉化而抑制脂肪組織炎癥。這為ADSC作為免疫調(diào)節(jié)細胞在臨床上治療肥胖和相關代謝疾病提供了新的思路。
　　方法:
　　1.飲食誘導肥胖小鼠模型的建立
　　8周齡C

2、57BL/6雄性小鼠分別給予高脂飲食喂養(yǎng)或常規(guī)對照飲食喂養(yǎng)。造模喂養(yǎng)共進行15周，期間每周進行小鼠體重的監(jiān)測，繪制成曲線。
　　2.脂肪來源間充質(zhì)干細胞(ADSC)的分離、擴增及鑒定
　　剝離C57BL/6雄性小鼠附睪處脂肪組織，剪碎后加入含有Ⅰ型膠原酶的KRB緩沖液消化。離心得到細胞沉淀，即為含有ADSC的脂肪組織基質(zhì)細胞(SVF)，可經(jīng)傳代培養(yǎng)進行純化。當細胞匯合度達到80％時（約6天左右），可進行傳代。檢測第三代ADS

3、C表面CD105、CD90、CD44以及CD11b、CD34、MHC-Ⅱ分子的表達情況。
　　3.ADSC體內(nèi)示蹤及體內(nèi)干預
　　3.1.ADSC的體內(nèi)示蹤
　　第三代的ADSC在對數(shù)生長期時，在培養(yǎng)基中加入EdU培養(yǎng)24h。通過對細胞進行Apollo(R)567及Hoechst染色檢測細胞標記效率。將標記效率高于90％的ADSC配制成1×106/ml的細胞懸液，注射于高脂喂養(yǎng)8周后的C57BL/6雄性小鼠。分別于注射

4、后3天和7天后處死小鼠，取附睪處脂肪組織進行EdU染色。熒光顯微鏡下觀察ADSC定位的情況。
　　3.2.ADSC的體內(nèi)干預
　　小鼠高脂8周之后，開始進行ADSC干預治療。以7天為一個周期，分別進行生理鹽水和ADSC細胞懸液的注射。整個干預時長6周。
　　4.ADSC治療對小鼠相關代謝參數(shù)的影響
　　ADSC治療過程中或治療后，分別對小鼠進行餐后血糖檢測、GTT和ITT實驗以及血清甘油三酯和總膽固醇檢測來驗證A

5、DSC治療對于小鼠代謝參數(shù)的影響。
　　5.ADSC治療對于高脂小鼠白色脂肪組織的影響
　　ADSC干預6次后處死小鼠，分別取各組小鼠附睪周圍的白色脂肪組織。對脂肪組織進行稱重，并對數(shù)據(jù)進行繪圖統(tǒng)計。對脂肪組織進行切片、HE染色，通過像素反映細胞大小并進行統(tǒng)計。提取脂肪組織的RNA，通過Real-time PCR的方法檢測脂肪組織相關的基因表達。
　　6.ADSC治療對脂肪組織炎癥的影響
　　6.1.免疫熒光檢測

6、巨噬細胞的浸潤
　　取各組脂肪組織切片進行免疫熒光染色，顯微鏡下觀察巨噬細胞表面標志CD68的表達情況并進行拍照。
　　6.2.脂肪組織塊體外培養(yǎng)檢測炎癥因子釋放
　　將小鼠脂肪組織碎塊進行培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清用于檢測炎性細胞因子的表達情況。采用CBA方法檢測脂肪組織培養(yǎng)上清中的相關炎性細胞因子IL-6、IFN-γ、IL-10、MCP-1、TNF-α、IL-12的表達。使用BD FACS Calibur Flow Cyt

7、ometer流式細胞儀中CBA試劑盒專用程序進行上機檢測，檢測結果由FCAP Array v1.0(BD biosciences)分析，數(shù)據(jù)繪制成柱狀圖并進行統(tǒng)計。
　　7.ADSC治療對于脂肪組織局部巨噬細胞表型的影響
　　分離提取出小鼠附睪處脂肪組織中的SVF，通過Real-time PCR的方式檢測小鼠SVF中iNOS、Arginase-1、IL-6、IL-10、TNF-α、IL-12等的mRNA水平的表達情況。流式細

8、胞術的方式檢測巨噬細胞表面標志的變化。以CD11b作為巨噬細胞的表面標志，用PE-CD11b熒光抗體標記SVF中的巨噬細胞，再以MHC-Ⅱ類分子、IL-10分別作為M1型和M2型的標志，通過陽性百分率與平均熒光強度來評價ADSC治療對于巨噬細胞表型的影響。
　　8.體外實驗研究ADSC對于巨噬細胞表型的影響
　　利用ADSC培養(yǎng)上清與腹腔巨噬細胞共培養(yǎng)的方式評估ADSC體外對于巨噬細胞表型變化的影響。用Real-time P

9、CR檢測ADSC對于M1型巨噬細胞表達IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α在mRNA水平的影響。Western blot的方法檢測iNOS，Arginase-1，以及信號通路中p-p65、p-STAT3、p-STAT6的表達變化。流式細胞術的方式檢測ADSC上清對于M1巨噬細胞MHC-Ⅱ類分子與IL-10的表達影響。
　　結果:
　　1.高脂飲食可減少小鼠附睪處脂肪組織內(nèi)ADSC的含量
　　流式細胞術分析的結果

10、表明，高脂喂養(yǎng)的肥胖小鼠脂肪組織內(nèi)ADSC的數(shù)量比例較常規(guī)飲食小鼠有明顯減少，可能是引發(fā)脂肪細胞功能紊亂和脂肪組織慢性炎癥的原因之一。
　　2.體外擴增的ADSC體內(nèi)轉輸時可成功定位于肥胖小鼠的白色脂肪組織
　　腹腔注射ADSC3天后即可在脂肪組織處觀察到紅色熒光標記的ADSC，而7天時紅色熒光的表達量和密度更高，提示體外擴增的ADSC通過腹腔注射的方法可以成功定位于腹內(nèi)白色脂肪組織中。
　　3.ADSC體內(nèi)干預可以改

11、善高脂小鼠的代謝失調(diào)
　　將高脂小鼠分為注射ADSC組(HFD-ADSC)和注射生理鹽水組(HFD-NS)，以正常飲食小鼠注射生理鹽水組(ND-NS)作為對照。較HFD-NS組而言，HFD-ADSC組治療后餐后血糖有下降趨勢。GTT和ITT結果表明，相對于HFD-NS組，HFD-ADSC組小鼠胰島素敏感性和葡萄糖耐性都有明顯的好轉，且在多時間點上均具有統(tǒng)計學差異。血清膽固醇和甘油三酯的檢測發(fā)現(xiàn)，HFD-NS組較ND-NS組血清甘油

12、三酯濃度明顯上調(diào)，而ADSC治療之后則呈現(xiàn)出顯著下調(diào)，而膽固醇變化則不大。
　　4.ADSC體內(nèi)干預可以減輕肥胖誘導的脂肪細胞肥大
　　對小鼠及其脂肪組織進行稱重發(fā)現(xiàn)，高脂喂養(yǎng)可以導致小鼠體重及白色脂肪組織重量的明顯增加，而ADSC治療對于小鼠體重以及白色脂肪組織的重量均無明顯影響。而通過細胞大小統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)ADSC治療確實明顯減小了脂肪細胞的大小，并且Leptin的mRNA表達水平明顯下調(diào)。同時檢測到PPAR-γ的表達在mRN

13、A水平上呈現(xiàn)出上升趨勢，但沒有統(tǒng)計學意義。而Adiponectin的表達并沒有檢測出明顯的差別。
　　5.ADSC治療可以減輕高脂飲食誘導的白色脂肪組織炎癥
　　小鼠外周血中炎癥因子的檢測結果顯示ADSC治療后小鼠血清中IL-6、TNF-α、IFN-γ、 IL-12以及MCP-1的表達均有下調(diào)的趨勢。而脂肪組織塊體外培養(yǎng)結果顯示，ADSC治療后的小鼠脂肪組織局部釋放出的促炎分子TNF-a明顯較HFD-NS組低，而抑炎分子IL

14、-10的表達則明顯升高。CD68標記巨噬細胞的免疫熒光結果顯示，ADSC治療后可明顯減少巨噬細胞形成的皇冠樣結構。以上結果表明，ADSC體內(nèi)干預后可以減輕白色脂肪組織炎癥。
　　6.ADSC體內(nèi)干預可誘導高脂小鼠白色脂肪組織中的巨噬細胞發(fā)生表型重塑
　　對各組小鼠脂肪組織處SVF mRNA表達水平的檢測結果表明，HFD-NS組較ND-NS組小鼠，其TNF-α、IL-12的表達明顯上調(diào)，而HFD-ADSC組小鼠則呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，

15、并且有統(tǒng)計學意義。與之相應，抑炎因子IL-10的表達也因ADSC治療呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢，iNOS與Arginase-1的比值在ADSC治療后顯示出降低的趨勢。流式分析結果顯示，ADSC治療組CD11b+巨噬細胞中MHC-Ⅱ類分子的表達顯著下調(diào);同時，IL-10在胞內(nèi)的表達則顯著上調(diào)。以上結果表明，ADSC體內(nèi)干預后可以誘導高脂小鼠白色脂肪組織中的巨噬細胞發(fā)生表型重塑。
　　7.ADSC可以促進巨噬細胞在體外的表型轉換
　　Rea

16、l-time PCR的結果顯示，經(jīng)LPS聯(lián)合IFN-γ誘導，M1型巨噬細胞高表達IL-6、TNF-α、IL-12等炎性因子，而加入ADSC培養(yǎng)上清后，TNF-α、IL-12的表達都受到了抑制，而IL-10的表達則呈現(xiàn)明顯的上調(diào)。蛋白水平的檢測結果顯示LPS聯(lián)合IFN-γ刺激后，巨噬細胞iNOS的表達明顯上調(diào)，表現(xiàn)為典型的M1型，而加入ADSC培養(yǎng)上清后，iNOS的上調(diào)明顯受到了抑制。同樣，流式分析結果顯示，LPS聯(lián)合IFN-γ刺激巨噬細

17、胞后，MHC-Ⅱ類分子的表達明顯上調(diào)，而ADSC共培養(yǎng)組顯示出相對低的表達水平。另外，抑炎分子IL-10的表達在ADSC共培養(yǎng)后也明顯上調(diào)。對通路分子檢測的結果顯示，ADSC可以上調(diào)p-STAT3，p-STAT6的表達而下調(diào)p-p65的表達，提示ADSC可以通過激活STAT3/STAT6通路，抑制NF-κB通路促進M1型巨噬細胞向M2轉化。以上結果顯示，ADSC可以通過培養(yǎng)上清作用于巨噬細胞，使得M1型巨噬細胞向M2抑炎表型轉換。