FOXO1及CGI-58在肥胖慢性炎癥與胰島素抵抗中的作用.pdf

1、肥胖癥是世界性的公共健康問題，是心血管疾病、2型糖尿病等代謝性疾病的高危因素。胰島素抵抗是肥胖相關(guān)的代謝性疾病發(fā)生發(fā)展的病理生理基礎(chǔ)。肥胖相關(guān)的慢性炎癥，是內(nèi)臟脂肪、肝臟及肌肉發(fā)生胰島素抵抗的始動因素。
　　 FOXO1是受胰島素信號負(fù)性調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控其靶基因，參與調(diào)節(jié)肝臟的糖異生、極低密度脂蛋白合成、氧化應(yīng)激以及凋亡等功能。近來報(bào)道FOXO1可在巨噬細(xì)胞中上調(diào)IL-1β的表達(dá)，在脂肪細(xì)胞中上調(diào)MCP-1及IL-6的表

2、達(dá)，提示FOXO1可能是聯(lián)系胰島素信號與促炎細(xì)胞因子表達(dá)的橋梁。動物及臨床研究顯示，單純脂肪肝向脂肪性肝炎發(fā)展過程中，肝臟FOXO1的表達(dá)水平顯著增強(qiáng)。然而，在胰島素抵抗的肝細(xì)胞中，F(xiàn)OXO1與促炎細(xì)胞因子表達(dá)的關(guān)系尚不清楚。
　　 肥胖導(dǎo)致的異位脂質(zhì)沉積，可導(dǎo)致肝臟、肌肉等組織產(chǎn)生慢性炎癥及胰島素抵抗。脂代謝紊亂導(dǎo)致的巨噬細(xì)胞脂毒性，可誘導(dǎo)抗炎型巨噬細(xì)胞(M2)向促炎型巨噬細(xì)胞(M1)轉(zhuǎn)化。內(nèi)臟脂肪組織中巨噬細(xì)胞浸潤及M1/M

3、2比例增高，是肥胖相關(guān)的脂肪組織慢性炎癥增強(qiáng)的重要原因。CGI-58是近來報(bào)道的甘油三酯水解的激活蛋白，廣泛表達(dá)于全身各組織細(xì)胞。其基因突變在人群中導(dǎo)致Chanarin-Dorfman綜合征，表現(xiàn)為多個組織臟器的中性脂肪沉積。巨噬細(xì)胞中CGI-58在自身脂代謝、全身慢性炎癥及胰島素抵抗中的作用，目前尚未見任何報(bào)道。
　　 [研究目的]
　　 1.在胰島素抵抗的小鼠肝臟中考察FOXO1與慢性炎癥的相關(guān)性，并在體外胰島素抵抗

4、的肝細(xì)胞模型上探討FOXO1對促炎細(xì)胞因子表達(dá)的影響及其調(diào)控機(jī)制；
　　 2.在巨噬細(xì)胞CGI-58特異性敲除的小鼠模型上考察巨噬細(xì)胞CGI-58敲除對自身及全身脂代謝、全身慢性炎癥及胰島素抵抗的影響及其機(jī)制。
　　 [研究方法]
　　 1.在db/db肥胖小鼠模型及高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型的肝臟中，應(yīng)用RT-PCR、real-time PCR、WB及ELISA等方法檢測FOXO1的表達(dá)活性與促炎細(xì)胞因子的表達(dá)

5、水平；并在體外的胰島素抵抗肝細(xì)胞模型中，上調(diào)或者下調(diào)FOXO1的表達(dá)活性，考察FOXO1對促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響；應(yīng)用報(bào)告基因分析、ChIP等實(shí)驗(yàn)方法，深入探討FOXO1對CCL20基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。
　　 2.構(gòu)建巨噬細(xì)胞CGI-58特異性敲除(MaKO)的小鼠模型，檢測腹腔巨噬細(xì)胞、肝臟、脂肪及血漿的脂質(zhì)代謝情況；應(yīng)用GTT、ITT、急性胰島素注射及高胰島素-正常葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)檢測MaKO及對照小鼠的胰島素敏感性；應(yīng)用

6、定量RT-real-time PCR、ELISA等方法檢測高脂喂養(yǎng)的MaKO小鼠內(nèi)臟脂肪、肝臟及全身的促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平；應(yīng)用內(nèi)毒素刺激，考察了原代分離的CGI-58缺失的腹腔巨噬細(xì)胞及MaKO小鼠的促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平；應(yīng)用定量RT-real-time PCR、WB、GTT、ITT等方法檢測抗氧化劑NAC對巨噬細(xì)胞CGI-58敲除誘導(dǎo)的慢性炎癥及胰島素抵抗的影響。
　　 [研究結(jié)果]
　　 1.FOXO1在肝臟胰島素

7、抵抗相關(guān)的慢性炎癥中的作用
　　 1.1.首先在肥胖胰島素抵抗的小鼠血漿及肝臟中，檢測了FOXO1表達(dá)水平與促炎因子及炎細(xì)胞浸潤的相關(guān)性。結(jié)果顯示：30周齡的db/db小鼠與同窩的雜合子db/+及WT小鼠相比，其體重、空腹血糖及胰島素水平顯著升高；其肝臟有大量脂質(zhì)沉積，且巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞浸潤增加；其肝臟MCP-1、IL-1β、IL-6、iNOS及CCL20等促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平升高；其肝臟FOXO1的表達(dá)顯著升高；高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)的

8、C57/B6肥胖小鼠，其肝臟MCP-1、IL-1β、IL-6及iNOS等促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平升高，同時FOXO1的表達(dá)與活性均顯著升高。
　　 1.2.進(jìn)一步在胰島素抵抗的肝細(xì)胞中觀察了FOXO1表達(dá)水平對炎癥因子基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示：低劑量的TNF-α長時間處理HepG2細(xì)胞，可顯著抑制胰島素刺激的AKT及IRS-1磷酸化，胰島素刺激的FOXO1磷酸化受到抑制，表明細(xì)胞內(nèi)胰島素抵抗(信號受損)模型的建立成功；TNF-α可促

9、進(jìn)HepG2細(xì)胞中p65的核轉(zhuǎn)位，并升高M(jìn)CP-1、IL-1β及IL-6等促炎細(xì)胞因子的mRNA水平；應(yīng)用特異的小干擾RNA將HepG2細(xì)胞中FOXO1的表達(dá)水平敲低，可顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的MCP-1、IL-1β及IL-6的mRNA水平。
　　 1.3.為了深入探討FOXO1調(diào)控促炎因子表達(dá)的機(jī)制，我們以T淋巴細(xì)胞趨化因子CCL-20為靶標(biāo)，采用基因轉(zhuǎn)染結(jié)合啟動子報(bào)告基因分析方法進(jìn)行了觀察，結(jié)果顯示：肝細(xì)胞中表達(dá)組成活性的F

10、OXO1可增強(qiáng)TNF-α誘導(dǎo)的CCL20 mRNA及蛋白分泌水平，而沉默內(nèi)源性FOXO1表達(dá)得到相反的結(jié)果；我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)FOXO1可增強(qiáng)TNF-α誘導(dǎo)的CCL20啟動子活性，其活性區(qū)域位于CCL20啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-108～-31區(qū)域；進(jìn)一步構(gòu)建位點(diǎn)特異性突變分析表明，CCL20啟動子上的NF-κB元件(-81～-70)在FOXO1聯(lián)合TNF-α對CCL20進(jìn)行調(diào)控中起作用；最后經(jīng)ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)，F(xiàn)OXO1可促進(jìn)p65/p50

11、異二聚體與CCL20啟動子上的NF-κB(-81～-70)元件相結(jié)合，促進(jìn)CCL20的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。
　　 1.4.為了考察FOXO1促進(jìn)CCL-20表達(dá)的功能意義，我們采用Boyden小室遷移實(shí)驗(yàn)觀察了TNF-α處理的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清對人血液單核細(xì)胞(PBMC)遷移的影響。結(jié)果表明，在此基礎(chǔ)上高表達(dá)組成活性的FOXO1可進(jìn)一步增強(qiáng)PBMC的遷移活性；而沉默F(xiàn)OXO1的表達(dá)可抑制TNF-α對PBMC遷移的誘導(dǎo)作用；而CCL2

12、0抗體可在顯著抑制TNF-α及FOXO1刺激的PBMC趨化功能。
　　 2.巨噬細(xì)胞CGI-58在脂代謝、慢性炎癥及胰島素抵抗中的作用
　　 2.1.首先，我們對巨噬細(xì)胞特異的CGI-58基因敲除(MaKO)小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞及肝臟、脂肪和血漿脂質(zhì)水平進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示：(MaKO)小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)大量脂質(zhì)沉積，脂質(zhì)譜分析表明甘油三酯(TG)水平顯著升高，而一些特殊種類的神經(jīng)酰胺(Ceramide)、磷脂酸(PA)及磷脂

13、酰肌(PI)水平降低；正常飲食的MaKO小鼠較之f1/f1對照小鼠，其肝臟TG水平降低，血液TG水平升高；小鼠巨噬細(xì)胞CGI-58敲除導(dǎo)致高脂飲食的小鼠肝臟總膽固醇(TC)水平降低。
　　 2.2.其次，我們觀察了不同年齡階段的MaKO小鼠全身胰島素敏感性的狀態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：高脂飲食(HFD)或者正常飲食(CD)16周的MaKO小鼠與f1/f1對照小鼠相比，體重、空腹及餐后血糖水平無基因型相關(guān)的差異；MaKO-HFD組較f1/f1

14、-HFD組空腹及餐后胰島素水平及HOMA-IR指數(shù)顯著升高；GTT及ITT實(shí)驗(yàn)提示MaKO-HFD組較f1/f1-HFD葡萄糖耐量及胰島素耐量均受損；急性胰島素注射實(shí)驗(yàn)表明MaKO-HFD組較之對照組小鼠，其胰島素刺激的內(nèi)臟脂肪、肌肉及肝臟中AKT磷酸化水平受損；進(jìn)一步，在35周HFD的小鼠上進(jìn)行的高胰島素一正常葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)表明：MaKO組的小鼠的葡萄糖輸注率顯著降低。這些結(jié)果表明：巨噬細(xì)胞CGI-58敲除加重了HFD誘導(dǎo)的全身胰島素

15、抵抗。
　　 2.3.進(jìn)一步我們觀察了MaKO小鼠血漿、肝臟、脂肪等組織細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：16周HFD的MaKO組小鼠較之對照組：其血漿TNF-α、IL-6及IL-18水平顯著升高；其肝臟及內(nèi)臟脂肪組織中炎性細(xì)胞浸潤增強(qiáng)，并伴隨著TNF-α、IL-1β等促炎細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平升高；流式細(xì)胞術(shù)表明其內(nèi)臟脂肪組織的血管間質(zhì)細(xì)胞浸潤增多，M1型巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞及T細(xì)胞數(shù)量增多，而巨噬細(xì)胞總量及單核細(xì)胞總量無明

16、顯差異；原代分離的內(nèi)臟脂肪細(xì)胞及脂肪組織中的巨噬細(xì)胞的IL-1β mRNA水平升高。這些結(jié)果表明：巨噬細(xì)胞CGI-58敲除加重了HFD誘導(dǎo)的全身慢性炎癥。
　　 2.4.為了考察CGI-58基因敲除對巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)性的影響，我們分離了原代MaKO小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，經(jīng)LPS刺激后，觀察了炎癥因子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：與對照組相比IL-1β表達(dá)和分泌特異性升高；CD或者HFD8周的MaKO小鼠經(jīng)腹腔注射LPS刺激30分鐘后，較之對

17、照組，其血漿IL-18水平升高，而IL-6、TNF-α等促炎細(xì)胞因子的水平無差異。
　　 2.5.為了進(jìn)一步探討IL-18和IL-1β特異性升高的機(jī)制，我們檢測了IL-18和IL-1β的上游炎性體信號通路。結(jié)果表明：MaKO小鼠來源的腹腔巨噬細(xì)胞較之對照組，LPS刺激的Nlrp3 mRNA水平顯著升高；16周HFD的MaKO小鼠較之對照組，其附睪脂肪、肝臟、附睪脂肪來源的巨噬細(xì)胞中Nlrp3的mRNA水平顯著升高；在基礎(chǔ)或者LP

18、S刺激下，MaKO小鼠來源的腹腔巨噬細(xì)胞較對照組Caspasel活性均顯著升高。這些結(jié)果提示：巨噬細(xì)胞CGI-58敲除激活了Nlrp3相關(guān)的炎性體信號通路。
　　 2.6.為探索巨噬細(xì)胞CGI-58敲除激活炎性體的機(jī)制，我們檢測了巨噬細(xì)胞中炎性體的活化信號活性氧(ROS)產(chǎn)生情況。結(jié)果表明：MaKO小鼠來源的腹腔巨噬細(xì)胞活性氧產(chǎn)生增加，并可被抗氧化劑NAC阻斷，進(jìn)而降低Caspasel的活性，抑制IL-1β的分泌；腹腔巨噬細(xì)胞與

19、附睪脂肪體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明：在LPS刺激下，MaKO來源的腹腔巨噬細(xì)胞較之對照組，顯著增強(qiáng)了脂肪組織的JNK及NF-κB炎癥信號，并進(jìn)一步抑制胰島素刺激的AKT磷酸化水平，而這一作用可被抗氧化劑NAC阻斷。這些體外實(shí)驗(yàn)表明：CGI-58缺失的巨噬細(xì)胞經(jīng)ROS-Caspasel途徑促進(jìn)IL-1β分泌，進(jìn)而增強(qiáng)內(nèi)臟脂肪的炎癥及胰島素抵抗。
　　 2.7.進(jìn)一步我們在動物水平驗(yàn)證了MaKO小鼠巨噬細(xì)胞中ROS介導(dǎo)的炎性體激活在加重全身

20、慢性炎癥及胰島素抵抗中的作用。結(jié)果表明：16周高脂喂養(yǎng)的MaKO小鼠較之對照組小鼠，其葡萄糖及胰島素耐量均受損，而給予4周NAC喂養(yǎng)可顯著改善MaKO組及對照組的糖耐量及胰島素耐量，并消除基因型之間的差異；NAC喂養(yǎng)后，高脂喂養(yǎng)的MaKO組較之對照組血漿IL-18及TNF-α水平無差異，而IL-6水平顯著降低；肝臟IL-6的mRNA水平降低，TNF-α、IL-1β等水平無差異；附睪脂肪的促炎細(xì)胞因子水平表達(dá)無差異；同時，炎性體相關(guān)基因N

21、lrp3及ASC的mRNA水平在肝臟和脂肪均無基因型相關(guān)的差異。這些結(jié)果表明：抗氧化劑NAC治療可顯著改善巨噬細(xì)胞CGI-58敲除加重的HFD誘導(dǎo)的全身慢性炎癥及胰島素抵抗。
　　 [主要結(jié)論]
　　 1.FOXO1在胰島素抵抗的肝細(xì)胞中可增強(qiáng)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)；可通過促進(jìn)p65/p50異二聚體與CCL20啟動子結(jié)合而增強(qiáng)肝細(xì)胞CCL20的表達(dá)和分泌，在胰島素抵抗肝組織炎細(xì)胞浸潤及炎癥加重過程中可能具有重要作用。

22、　　 2.巨噬細(xì)胞CGI-58缺失可誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生，激活炎性體信號通路，促進(jìn)IL-1β及IL-18的分泌，增強(qiáng)高脂誘導(dǎo)的全身慢性炎癥，從而加重全身胰島素抵抗。
　　 [研究意義]
　　 胰島素抵抗的肝細(xì)胞中FOXO1增強(qiáng)促炎細(xì)胞因子及趨化因子基因表達(dá)的現(xiàn)象，為揭示胰島素抵抗加重慢性炎癥的分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。巨噬細(xì)胞CGI-58與全身慢性炎癥及胰島素抵抗關(guān)系的闡明，揭示了巨噬細(xì)胞脂質(zhì)異常沉積主要通過ROS途徑在慢性炎