MiRNA調(diào)控抵抗素誘導(dǎo)的胰島素抵抗及脂肪異位沉積作用機(jī)制研究.pdf

1、脂肪組織除了作為機(jī)體最大的能量儲存器官外，還能夠分泌大量的細(xì)胞因子，統(tǒng)稱為脂肪細(xì)胞因子。抵抗素是近年來發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)控動(dòng)物糖、脂代謝及胰島素敏感性的重要的脂肪細(xì)胞因子，已有的證據(jù)表明，抵抗素在胰島素抵抗和脂質(zhì)異位沉積中發(fā)揮重要作用。近年來發(fā)現(xiàn)的一種小分子miRNA，可以通過抑制靶基因的翻譯而參與哺乳動(dòng)物許多生物學(xué)過程的調(diào)控。本研究以人和小鼠抵抗素為研究對象，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western Blotting、細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、雙熒光素酶

2、報(bào)告系統(tǒng)以及染色質(zhì)免疫共沉淀等技術(shù)，對miRNA參與抵抗素誘導(dǎo)的胰島素抵抗及脂質(zhì)異位沉積調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴采用芯片技術(shù)，對抵抗素處理及對照小鼠肝臟組織miRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抵抗素處理引起上調(diào)miRNA有25個(gè)，下調(diào)miRNA為51個(gè)，表明在抵抗素處理后小鼠肝臟組織miRNA呈現(xiàn)差異性表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果與芯片結(jié)果一致。⑵利用生物信息學(xué)方法對差異表達(dá)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測及信

3、號通路分析，結(jié)果顯示差異表達(dá)miRNA涉及眾多糖、脂代謝、線粒體及炎癥相關(guān)基因（如C/EBPβ、GSK3β、PPARα、ACSL1、SREBP1、NRF1、IRS-1、IRS-2、Sirt1、TNF等）及信號通路（如AMPK信號通路、胰島素信號通路、脂肪細(xì)胞因子信號通路、PPAR信號通路、脂肪酸氧化信號通路、氧化磷酸化信號通路以及T2DM信號通路等）的轉(zhuǎn)導(dǎo)。⑶以HepG2細(xì)胞為模型，通過細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，研究了miR-145在抵抗素誘導(dǎo)胰島

4、素抵抗中的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果表明，人重組抵抗素在HepG2細(xì)胞通過p65依賴的方式上調(diào)miR-145的表達(dá)，上升的miR-145以IRS-1為靶基因損傷胰島素信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制細(xì)胞對葡萄糖的吸收，導(dǎo)致肝臟胰島素抵抗的發(fā)生。⑷研究了miR-34a在抵抗素誘導(dǎo)脂肪異位沉積中的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果表明，miR-34a在脂肪肝模型小鼠肝臟中顯著上升，且重組抵抗素能夠顯著上調(diào)HepG2細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)。過表達(dá)的miR-34a增加了HepG2細(xì)胞甘

5、油三酯的含量，但線粒體數(shù)量下調(diào)，線粒體膜電位也顯著降低。通過雙熒光素酶報(bào)告基因及WesternBlotting表明miR-34a能夠以AdipoR2為靶基因，調(diào)控其蛋白水平表達(dá)。⑸Western Blotting分析表明，miR-34a通過AdipoR2抑制了PPARα信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起SREBP-1c的上調(diào)，從而增加胞內(nèi)甘油三酯的合成;miR-34a的過表達(dá)同時(shí)損傷了AMPK信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起ACC1α磷酸化水平的下調(diào)及CTP1α

6、蛋白表達(dá)的抑制，造成胞內(nèi)脂肪酸氧化受阻，從而進(jìn)一步增加了甘油三酯的聚集。⑹乙?；綑z測結(jié)果表明，miR-34a通過抑制Sirt1的蛋白水平而導(dǎo)致PGC-1α乙?；潭仍黾?，抑制了PGC-1α對核呼吸因子NRF1的轉(zhuǎn)錄激活作用，從而引起細(xì)胞線粒體數(shù)目的下降。⑺ChIP研究結(jié)果表明，C/EBPβ能夠直接結(jié)合在miR-34a的啟動(dòng)子上激活其轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而siC/EBPβ則能夠回復(fù)抵抗素對miR-34a的上調(diào)作用，表明抵抗素通過C/EBPβ而調(diào)