人剪切修復(fù)基因XPD對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的研究.pdf

1、目的研究表明，人剪切修復(fù)基因著色性干皮病基因D(Xeroderma Pigmentosum D，XPD)作為重要的DNA修復(fù)路徑----核苷酸切除修復(fù)中的關(guān)鍵因子，在DNA修復(fù)路徑中起著重要的作用。XPD基因發(fā)生突變時(shí)，腫瘤易感性更高。本實(shí)驗(yàn)研究野生型XPD基因?qū)Ω伟┘?xì)胞生長(zhǎng)的影響，探討XPD基因抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制。 方法: 用堿裂解法提取空載質(zhì)粒pEGFP-N2和重組質(zhì)粒pEGFP-N2-XPD，提取出的質(zhì)粒以KPNⅠ、B

2、GIⅡ和SPHⅠ酶切鑒定。實(shí)驗(yàn)分三組，重組質(zhì)粒XPD-N2、空載質(zhì)粒N2，并用與XPD-N2、N2具有相同遺傳背景和代數(shù)的SMMC-7721細(xì)胞作為空白對(duì)照。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染三組細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后綠色熒光蛋白報(bào)告基因表達(dá)情況。提取各組細(xì)胞總RNA，合成cDNA，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)三組細(xì)胞中XPD、c-myc、cda25A、cdK2表達(dá)情況。使用蛋白抽提液分別提取三組細(xì)胞的總蛋白，使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定蛋白濃度

3、，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中XPD、c-myc、cdc25A、cdK2表達(dá)量變化。流式細(xì)胞儀器檢測(cè)細(xì)胞周期，分析細(xì)胞各周期的百分率。在96孔板中進(jìn)行三組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，MTT法觀察細(xì)胞增殖的活力。 結(jié)果: 1、提取出的重組質(zhì)粒pEGFP-N2-XPD用酶切鑒定，與Genebank中公布的人類(lèi)XPD完整mRNA序列NM_000400相吻合。 2、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后40h，在熒光顯微鏡下，可以在SMMC-7721-pE

4、GFP-N2，SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD中觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)。 3、RT-PCR、Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD細(xì)胞與SMMC-7721-pEGFP-N2和SMMC-7721兩對(duì)照組相比，其XPD表達(dá)明顯增高；c-myc、cdc25A、cdK2相對(duì)表達(dá)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4、流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示：與其它二組相比，轉(zhuǎn)染了pEGFP-N2-XPD