全反式維甲酸聯(lián)合肝靶向免疫基因藥物對(duì)人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響.pdf

1、目的：目前肝癌的發(fā)病率和死亡率都比較高，單一用藥容易產(chǎn)生耐藥性，因此，聯(lián)合用藥成為肝癌治療的熱點(diǎn)之一。ATRA在臨床上用于部分實(shí)體瘤的治療，但由于其用藥劑量較大，毒副作用也較大，限制了其廣泛使用。轉(zhuǎn)鐵蛋白-脂質(zhì)-聚乙烯亞胺-DNA復(fù)合物(Tf-LPD)能夠有效沉默端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)從而達(dá)到對(duì)肝癌的治療目的。本實(shí)驗(yàn)將ATRA與Tf-LPD聯(lián)合使用，以增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)ATRA的敏感性，降低ATRA的用藥劑量，及二者聯(lián)合用藥對(duì)TERT基

2、因和蛋白的影響。
　　 方法：本研究分為三部分，首先制備轉(zhuǎn)鐵蛋白-脂質(zhì)-聚乙烯亞胺-DNA復(fù)合物(Tf-LPD復(fù)合物)，并考察其制劑學(xué)性質(zhì)；其次用Tf-LPD復(fù)合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，并確定ATRA單獨(dú)用藥量和用藥時(shí)間，ATRA與基因藥物聯(lián)合用藥量的確定；最后對(duì)兩藥聯(lián)用的RT-PCR結(jié)果和Western blot結(jié)果進(jìn)行分析，考察二者聯(lián)用對(duì)TERT基因和蛋白的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.確定PEI/

3、DNA壓縮體的N/P摩爾比為10，liposome與pDNA的摩爾比值為200。Tf-LPD復(fù)合物的抗酶切能力較強(qiáng)，在血清中及4℃放置兩周條件下都比較穩(wěn)定，不會(huì)發(fā)生聚沉現(xiàn)象。轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，Tf-LPD復(fù)合物對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染能力明顯高于PEI/DNA縮合體和LPD復(fù)合物。
　　 2.將治療質(zhì)粒制備成Tf-LPD復(fù)合物，轉(zhuǎn)染細(xì)胞并成功篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。ATRA單獨(dú)用藥作用于SMMC-7721細(xì)胞呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性和劑量依賴性，確定ATRA

4、的合適用藥時(shí)間為用藥后48h，用藥濃度為1.41×10-4 mol·L-1，ATRA作用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系時(shí)，合適的用藥濃度為3.5×10-5mol·L-1。
　　 3.經(jīng)鑒定所提取的細(xì)胞總RNA降解和污染較少，質(zhì)量符合要求。PCR檢測(cè)結(jié)果為ATRA對(duì)TERT基因有抑制作用，Tf-LPD對(duì)TERT的抑制作用較強(qiáng)，兩藥聯(lián)用后對(duì)TERT的抑制作用增強(qiáng)，與單獨(dú)用藥相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用提取的細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)