全反式維甲酸調(diào)控miRNA200s逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、目的：體外探討全反式維甲酸(all-trans-retinoic acid, ATRA)是否通過調(diào)控microRNA200家族(miR200s)逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞的上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖遷徙侵襲，促進(jìn)其成熟分化，并尋找相關(guān)下游靶基因，探討可能的分子生物學(xué)機(jī)制，為ATRA用于肝癌的臨床治療提供新的思路。
　　方法：以小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-

2、6為研究對象，首先體外給予0、0.1、1.0和10.0μmol/L不同終濃度的ATRA處理，臺盤藍(lán)拒染實驗計數(shù)細(xì)胞，繪制細(xì)胞生長曲線，克隆形成實驗、結(jié)晶紫染色檢測細(xì)胞增殖及克隆形成能力；Hoechst檢測細(xì)胞凋亡，劃痕實驗檢測細(xì)胞的平行遷徙能力，Transwell實驗檢測縱向遷徙及侵襲能力。熒光定量PCR(real-time PCR)法檢測肝前體細(xì)胞標(biāo)志甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)及成熟肝細(xì)胞標(biāo)志白蛋白(al

3、bumin, ALB)和細(xì)胞角蛋白18(cytokeratin18, CK18)，酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(tyrosine aminotransferase, TAT)，載脂蛋白B(Apo lipoprotein B, ApoB)的mRNA水平表達(dá)；Western Blot及免疫熒光檢測AFP、ALB、CK18的蛋白水平表達(dá)。吲哚菁綠(Indocyanine green，ICG)攝取釋放實驗及過碘酸希夫(Periodic acid-Schiff，

4、PAS)染色檢測細(xì)胞的代謝解毒及糖原合成功能。Real-time PCR檢測上皮標(biāo)志蛋白-上皮細(xì)胞鈣粘蛋白(epithelia cadherin, E-cadherin)，以及間質(zhì)標(biāo)志蛋白：神經(jīng)型鈣粘蛋白(nerve cadherin, N-cadherin)、鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子snail、波形蛋白Vimentin和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化因子twist的mRNA表達(dá)。初步篩選出對Hepa1-6細(xì)胞作用最佳的ATRA濃度。
　　其次，體外用最

5、佳濃度的ATRA處理Hepa1-6細(xì)胞，real-time PCR檢測miR200s的表達(dá)情況，篩選出表達(dá)變化具有顯著差異的miR200成員miR200a-3p、miR200c-3p、miR141-3p。采用抑制miRNA200功能的三種特異性miRNA antagomir處理Hepa1-6細(xì)胞，再用最佳濃度的ATRA繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，分為：a.空白對照組；b. ATRA組；c. miRNA antagomir Negative Contr

6、ol(NC)+ATRA組；d. miR-200s antagomir+ATRA共三組。MTT分析法檢測細(xì)胞增殖情況，克隆形成實驗檢測細(xì)胞克隆形成，Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，劃痕實驗檢測細(xì)胞的平行遷徙能力，Transwell實驗檢測縱向遷徙能力及侵襲能力，Real-time PCR檢測成熟肝細(xì)胞標(biāo)志蛋白ALB、CK18的表達(dá)，ICG及PAS染色檢測細(xì)胞的成熟分化作用。轉(zhuǎn)錄因子芯片檢測ATRA處理前后3

7、45種轉(zhuǎn)錄因子活性，獲得差異因子，生物信息學(xué)分析可能受miR-200分子調(diào)控的差異因子靶基因，并進(jìn)行real-time PCR法及western blot驗證。
　　結(jié)果：第一部分：0.1、1.0和10.0μmol/L ATRA處理后Hepa1-6細(xì)胞的增殖、遷徙、侵襲能力較control組明顯下降(P＜0.05)，凋亡率增加，ICG攝取及PAS染色陽性細(xì)胞數(shù)顯著增多(P＜0.05)，上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin，CK18及成

8、熟肝細(xì)胞標(biāo)志ALB、CK18、TAT、ApoB的表達(dá)明顯上調(diào)，肝腫瘤細(xì)胞標(biāo)志AFP下降，間質(zhì)標(biāo)志蛋白N-cadherin，Vimentin、Snail、Twist的表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05)，這些調(diào)節(jié)作用呈現(xiàn)出對ATRA的劑量依賴性，10.0μmol/L ATRA組的作用最強(qiáng)。
　　第二部分：1) Real-time PCR結(jié)果顯示10.0μmol/LATRA誘導(dǎo)后Hepa1-6細(xì)胞中miRNA200a-3p、200c-3p、1

9、41-3p的mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05)，而其他7個miR200家族分子的表達(dá)與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。2) ATRA處理后Hepa1-6細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲以及成熟分化作用較對照組出現(xiàn)與第一部分相同的作用趨勢。NC+ATRA組與ATRA誘導(dǎo)組Hepa1-6細(xì)胞的增殖、凋亡率、遷移、侵襲能力、成熟肝細(xì)胞標(biāo)志表達(dá)及分化能力均無差異(P＞0.05)。而與NC+ATRA組相比，miR-200a/200c/141

10、-3p antagomir+ATRA三組Hepa1-6細(xì)胞的增殖率、劃痕愈合率及侵襲細(xì)胞均增多(P＜0.05)，其中miR-200a/200c-3p antagomir+ATRA兩組增多更明顯，甚至達(dá)到control組水平，但三組克隆形成率均較NC+ATRA組無差異；同時三組凋亡率均較NC+ATRA組均明顯下降(P＜0.05)。只有miR-200a/200c-3p antagomir+ATRA兩組與NC+ATRA組相比，transwel

11、l縱向遷移能力增強(qiáng)，ALB、CK18的mRNA表達(dá)下調(diào)，PAS及ICG陽性細(xì)胞數(shù)減少(P＜0.05)，miR-141-3p antagomir不影響ATRA對肝癌細(xì)胞的縱向遷移和促進(jìn)分化成熟作用。3)轉(zhuǎn)錄因子芯片結(jié)果顯示ATRA處理后有8個轉(zhuǎn)錄因子活性上調(diào)，35個轉(zhuǎn)錄因子活性下調(diào)，生物信息學(xué)結(jié)果分析miR-200a/200c/141-3p與klf12、zeb1、Pou4f1、Ets1、Jun基因相關(guān)，相對應(yīng)于AP2、AREB1、Brn-

12、3、Ets1/PEA3及Fra-1/JUN轉(zhuǎn)錄因子，而其他7個miR-200亞型與ATRA調(diào)控的43個差異因子均不相關(guān)。ATRA誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)錄因子Jun、Fra-1、Pouf1、Etv4、zeb1的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，klf12表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)。并且miR-200a/200c/141-3p antagomira特異性抑制了miR-200a/200c/141-3p的生物學(xué)作用后，三組較miRNA Negative control組J

13、un、Fra-1、Pouf1、Etv4、zeb1的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05)，Klf12的蛋白表達(dá)未見明顯改變。
　　結(jié)論：ATRA呈濃度依賴性逆轉(zhuǎn)小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡及成熟分化，并具有成熟肝細(xì)胞的合成代謝功能。
　　ATRA可能通過調(diào)控miR-200a-3p、miR-200c-3p、miR-141-3p逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其中miR-200a-3