Nutlin-3逆轉(zhuǎn)吉西他濱耐藥肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　我國是肝癌的“重災(zāi)國”。晚期肝癌的治療一直以來是臨床中亟需予以克服的難題。分子靶向藥物索拉非尼（Sorafenib）是晚期肝癌的標(biāo)準(zhǔn)治療，但只有中等程度的獲益。近年來，以吉西他濱（Gemcitabine，GEM）和奧沙利鉑（Oxaliplatin， OXA）為代表的新型細(xì)胞毒藥物在晚期肝癌的治療上顯示出良好的前景。然而，獲得性耐藥仍然是制約此類藥物在晚期肝癌中發(fā)揮最大效能的主要因素。
　　為了探索肝癌的

2、耐藥機(jī)制以及尋求克服耐藥的治療策略，在既往研究中我們建立了GEM耐藥肝癌模型，發(fā)現(xiàn)GEM耐藥肝癌細(xì)胞發(fā)生了上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT），進(jìn)一步研究表明EMT的發(fā)生可能是肝癌細(xì)胞對GEM產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，探討Nutlin-3對GEM耐藥肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT的逆轉(zhuǎn)作用及其分子機(jī)制，為以逆轉(zhuǎn)EMT信號通路為靶點(diǎn)克服耐藥應(yīng)用于臨床提供新的理論基礎(chǔ)。
　

3、　方法：
　　1.在既往已經(jīng)建立的肝細(xì)胞癌HepG2和SMMC-7721的GEM耐藥細(xì)胞模型（以下簡稱“HepG2 GR”和“SMMC-7721 GR”細(xì)胞）基礎(chǔ)上，采用MTT法檢測Nutlin-3對HepG2 GR和SMMC-7721 GR細(xì)胞的敏感性并繪制增殖曲線。
　　2.觀察Nutlin-3干預(yù)HepG2 GR和SMMC-7721 GR細(xì)胞后發(fā)生的形態(tài)學(xué)改變，并通過細(xì)胞劃痕、遷移侵襲、粘附和分離實(shí)驗(yàn)考察干預(yù)前后生物學(xué)

4、活性的變化。
　　3.利用實(shí)時熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）和蛋白質(zhì)印跡法（Western-Blot）檢測Nutlin-3干預(yù)HepG2 GR和SMMC-7721 GR細(xì)胞前后EMT分子表型E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、Snail和Slug的表達(dá)情況。
　　4.在肝癌親本（HepG2和SMMC-7721）和GEM耐藥肝癌細(xì)胞（Hep

5、G2 GR和SMMC-7721 GR）中，以qRT-PCR、Western-Blot法檢測GEM耐藥肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT過程中Smad2的mRNA水平和蛋白表達(dá)；Nutlin-3干預(yù)GEM耐藥肝癌細(xì)胞，以qRT-PCR、Western-Blot法檢測Smad2 mRNA水平和蛋白表達(dá)情況。
　　5.在HepG2 GR中，通過Smad2 siRNAs瞬時沉默Smad2基因表達(dá)，驗(yàn)證干擾效率后，以qRT-PCR、Western-Blot

6、法測定E-cadherin、Vimentin、Snail和Slug的表達(dá)，考察Smad2瞬時沉默對GEM耐藥肝癌細(xì)胞EMT分子表型的影響。
　　6.在HepG2 GR中，轉(zhuǎn)染Smad2 siRNA1后，通過形態(tài)學(xué)觀察、遷徙侵襲、劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞粘附和分離實(shí)驗(yàn)，考察Smad2瞬時沉默對耐藥肝癌細(xì)胞EMT生物學(xué)特征的影響。
　　結(jié)果：
　　1.Nutlin-3對GEM耐藥肝癌細(xì)胞（HepG2 GR和SMMC-7721 GR）

7、的增殖產(chǎn)生抑制作用。
　　2.Nutlin-3干預(yù)GEM耐藥肝癌細(xì)胞（HepG2GR和SMMC-7721 GR）后，發(fā)生了形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞極性逐漸恢復(fù)、偽足減少，細(xì)胞呈卵圓形，且聚集生長。
　　3.Nutlin-3干預(yù)GEM耐藥肝癌細(xì)胞（HepG2 GR和SMMC-7721GR）后，耐藥細(xì)胞運(yùn)動能力減弱，侵襲能力下降。
　　4.Nutlin-3可逆轉(zhuǎn)GEM耐藥肝癌細(xì)胞（HepG2 GR和SMMC-7721 GR）EMT

8、分子表型，EMT分子表型E-cadherin表達(dá)上調(diào)，Vimentin、Snail、Slug表達(dá)下調(diào)。
　　5.Smad2在GEM耐藥肝癌細(xì)胞（HepG2GR和SMMC-7721 GR）中較親本細(xì)胞顯著高表達(dá)，Nutlin-3可下調(diào)GEM耐藥肝癌細(xì)胞中Smad2表達(dá)。
　　6.瞬時沉默GEM耐藥肝癌細(xì)胞（HepG2 GR）中Smad2表達(dá)，可逆轉(zhuǎn)HepG2 GR細(xì)胞EMT分子表型，改變HepG2 GR細(xì)胞生物學(xué)特性。