DHA對人肝癌細胞凋亡和侵襲力的影響及其機制研究.pdf

1、【目的】(1)檢測不同濃度二十二碳六烯酸(DHA)對人肝癌細胞株Bel-7402細胞增殖的影響。(2)研究不同濃度DHA對Bel-7402細胞凋亡的影響并進一步探討其誘導凋亡的可能作用機制。(3)分析不同濃度DHA對肝癌細胞侵襲力的影響,并檢測其作用肝癌細胞48h后基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達的變化,為肝癌的轉移和復發(fā)提供新的理論基礎。
　　【方法】(1)通過甲基噻唑基四唑比色法(MTT)、臺酚藍拒染實驗檢測不同濃度DHA

2、對Bel-7402細胞增殖的影響。(2)運用流式細胞儀檢測(FCM)檢測早期細胞凋亡的情況,并通過實時聚合酶鏈反應(Real-timePCR)、蛋白質(zhì)免疫印跡(WesternBlot)方法檢測不同濃度DHA作用細胞后Bim基因、抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax表達的影響;再用半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)凋亡檢測試劑盒檢測caspase-3表達相對值的變化。(3)通過細胞劃痕及侵襲小室(Transwell)方法檢測DHA

3、對Bel-7402肝癌細胞遷移能力和侵襲力的影響;再運用細胞免疫組化染色方法檢測MMP-9表達的影響。
　　【結果】(1)與對照組(0μmol/LDHA)比較,不同濃度DHA對Bel-7402肝癌細胞的增殖均有明顯抑制作用,且呈時間—劑量依賴性(P<0.05)。(2)在作用Bel-7402細胞48h后,不同濃度DHA(25,50,100,200μmol/L)處理組細胞出現(xiàn)早期凋亡率分別為10.28±2.28％,19.49±2.21

4、%,25.20±5.53%和35.01±6.01%,與對照組(0.02±0.01%)相比,各組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時檢測線粒體凋亡通路中與細胞凋亡密切相關的各蛋白表達變化,與對照組比較,各個DHA處理組促凋亡基因Bim基因mRNA表達顯著升高,并與DHA濃度呈正比,其相對表達量有統(tǒng)計學差異(P<0.05);抗凋亡蛋白Bcl-2的表達明顯降低,而促凋亡蛋白Bax的表達顯著升高;凋亡蛋白caspase-3的相對活性顯著增加,

5、差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),并呈劑量依賴性。(3)在Transwell侵襲實驗中,DHA(50、100、200μmol/L)處理組透膜細胞數(shù)與對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);在細胞劃痕實驗中,動態(tài)觀察0、12、24h,對照組細胞劃痕間距明顯縮短,24h后劃痕基本愈合,DHA(50、100、200μmol/L)處理組隨著DHA濃度的增大,細胞劃痕間距縮短的趨勢越小,各時段與對照組間比較差異顯著。其中,DHA(25μmo

6、l/L)處理組與對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義。不同濃度DHA作用48h后,細胞免疫組化結果顯示,細胞MMP-9的表達隨DHA濃度的增加而逐漸減少,其影響呈劑量相關性。
　　【結論】(1)DHA可抑制人肝癌細胞Bel-7402的增殖并誘導細胞早期凋亡,且呈時間—劑量依賴性。(2)通過檢測線粒體凋亡通路上多種蛋白表達變化,推測DHA誘導細胞凋亡的機制可能與激活線粒體凋亡通路有關。(3)DHA能在一定程度上抑制肝癌細胞的侵襲并降低其遷移