TGF-β1誘導(dǎo)的Fascin1基因表達(dá)對胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移影響的研究.pdf

1、前言：胃癌是一種常見的惡性腫瘤，據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報道，在我國其死亡率居各種惡性腫瘤之首。胃癌患者的主要死因為腫瘤病灶的侵襲及轉(zhuǎn)移。因此探討其侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制顯得尤為重要。 在眾多的促轉(zhuǎn)移分子中，轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor beta，TGFβ)是一重要分子，它參與了多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。用基因轉(zhuǎn)染的方法誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中TGF-β1表達(dá)可增加腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。同時有研究表明，阻止TGF-β信號通路

2、可以抑制胃癌的轉(zhuǎn)移。我們的早期研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC7901和BGC823的浸潤和轉(zhuǎn)移。一些臨床研究也顯示：TGF-β1的表達(dá)與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良呈正相關(guān)。目前雖然已有許多研究證實了TGF-β1在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用，但其具體機(jī)制尚不明確。 研究表明TGF-β促浸潤轉(zhuǎn)移作用可由smad依賴通路及smad非依賴通路介導(dǎo)。TGF-β與細(xì)胞膜II型受體(Tβ RII)結(jié)合后，激活I(lǐng)型受體，活化的I型受體激活下

3、游分子smad2和smad3，隨后smad2/smad3與smad4結(jié)合形成smad復(fù)合物并轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，調(diào)節(jié)TGF-β介導(dǎo)的靶基因轉(zhuǎn)錄。而在smad非依賴通路中，JNK，Erk和P38通路則被認(rèn)為是關(guān)鍵性的通路。基于TGF-β在腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移中的重要性，所以深入探討TGF-β促轉(zhuǎn)移機(jī)制具有非常重要的理論及臨床意義。 人類fascin1基因?qū)儆趂ascin家族，其蛋白質(zhì)編碼產(chǎn)物是一種分子量為55 kDa的細(xì)胞骨架蛋白，可與F肌動蛋

4、白結(jié)合，定位于細(xì)胞質(zhì)張力纖維和細(xì)胞膜皺褶( ruffles)邊緣與細(xì)胞的運動、癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系的公狀偽足、微棘(microspikes)的核心肌動蛋白束中。細(xì)胞內(nèi)fascin1基因表達(dá)上調(diào)引起細(xì)胞間連接發(fā)生解離，同時細(xì)胞的運動也相應(yīng)增加。而將fascin1基因轉(zhuǎn)染至fascin l基因低表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW1222中，結(jié)果細(xì)胞膜表面突起增多，細(xì)胞分化程度降低，細(xì)胞運動性增強(qiáng)。Fascin蛋白在胃癌中表達(dá)明顯增高，它的高表達(dá)與胃

5、癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和復(fù)發(fā)密切相關(guān)。有研究表明在肺癌中TGF-β1可誘導(dǎo)fascinl基因表達(dá)上調(diào)，且TGF-β1和fascinl蛋白都與肺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移有關(guān)，但是目前TGF-β與fascinl在胃癌侵襲與轉(zhuǎn)移中是否存在調(diào)控關(guān)系尚未見文獻(xiàn)報道。 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是近年來發(fā)展起來的一種新技術(shù)，由于它能特異而有效地阻斷靶基因的表達(dá)，目前被廣泛應(yīng)用于各種腫瘤的研究。我們構(gòu)建了針

6、對Fascinl的短發(fā)夾RNA(shortharpin RNA，shRNA)真核表達(dá)載體并首次轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞MKN45，觀察抑制fascinl表達(dá)前后，TGF-β1作用對胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，并對其機(jī)制作初步探討。 目的：研究TGF-β1對fascinl基因表達(dá)的影響，以及fascinl在TGF-β促胃癌侵襲與轉(zhuǎn)移中的作用。探討以fascinl為靶的胃癌基因治療以及進(jìn)一步揭示TGF-B1促胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制提供理論和實驗依據(jù)。

7、 方法： 1.通過細(xì)菌轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切、凝膠電泳、基因測序鑒定和基因重組技術(shù)等方法構(gòu)建針對Fascinl的RNAi質(zhì)粒pGen-1-FSCN1和陰性對照質(zhì)粒pGen-1-con。 2.利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞MKN45，經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定抑制fascinl表達(dá)的胃癌細(xì)胞模型(pGen-1-FSCN1細(xì)胞)；分別采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)( RT-PCR)和Western blotting檢測RNAi

8、組(siFascinl)、對照組(CON)及未轉(zhuǎn)染組(NT)三組細(xì)胞中Fascinl的表達(dá)。 3.以10ng/ml的TGFβ1處理siFascinl，CON，NT三組胃癌細(xì)胞，觀察處理前后各組細(xì)胞生物學(xué)行為的變化，采用MTT比色法測定細(xì)胞的黏附能力，Boyden小室測定法測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力；腹腔移植法建立裸鼠胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移模型。 4.分別瞬時轉(zhuǎn)染smad2，smad4的siRNA(small interfer

9、ing RNA)，檢測smad依賴通路在TGF-β誘導(dǎo)fascinl促胃癌浸潤與轉(zhuǎn)移中的作用；應(yīng)用JNK，Erk和P38通路的特異性抑制劑檢測smad非依賴通路在TGF-β誘導(dǎo)fascinl促胃癌浸潤與轉(zhuǎn)移中的作用。 結(jié)果： 1.TGF-β1(10ng/ml)在作用于MKN45細(xì)胞24小時后，fascinl基因表達(dá)約為0小時的2.2倍。 2.限制性酶切及基因測序證實成功構(gòu)建了針對fascinl基因的RNAi載體p

10、Gen-1-FSCNl。經(jīng)G418篩選，RT-PCR及Western blotting鑒定，成功建立了穩(wěn)定抑制fascinl基因表達(dá)的胃癌細(xì)胞模型。 3.與CON和NT比較，siFascinl細(xì)胞的黏附能力、遷移能力、侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力明顯降低(p<0.05)：三組細(xì)胞經(jīng)TGF-β1(10ng/ml)預(yù)處理后，其中CON與NT細(xì)胞黏附能力、遷移能力、侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力明顯增高(p<0.05)；而在siFascinl組，TGF-β

11、1處理前后細(xì)胞黏附能力、遷移能力、侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力無明顯變化( p>0.05)0 4.分別瞬時轉(zhuǎn)染smad2，smad4的siRNA于MKN45細(xì)胞中，予TGF-β1處理后，經(jīng)western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，MKN45中smad2，smad4的表達(dá)水平較未轉(zhuǎn)染前減少約70％，而在干擾smad2，smad4后，MKN45細(xì)胞中的fascinl表達(dá)無明顯變化；選用JNK，Erk和P38通路的特異性抑制劑，SP600125

12、，PD98095和SB203580分別預(yù)孵育MKN45細(xì)胞1h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：SP600125和PD98095組予TGF-β1處理24小時后，fascinl的表達(dá)明顯降低(p<0.05)，而P38通路的特異性抑制劑SB203580對fascinl的表達(dá)無明顯影響。 結(jié)論： 1.首次證實，在胃癌細(xì)胞MKN45中fascinl基因表達(dá)受外源性TGF-β1(10ng/ml)調(diào)控。 2.成功構(gòu)建了針對fascinl基因的RN