TGFβ1對(duì)胃癌浸潤轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、基因不穩(wěn)定和基因變異的積累可影響生長因子和抑制因子之間的平衡，使腫瘤侵襲性增強(qiáng)、新生血管形成，最終引起腫瘤的轉(zhuǎn)移。浸潤與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤重要的生物學(xué)特征，是臨床上大多數(shù)腫瘤患者的致死原因；因此，有效地針對(duì)腫瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移進(jìn)行治療是腫瘤治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而深入探討腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋求藥物治療的新靶點(diǎn)則成為腫瘤研究工作的重點(diǎn)。 轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming grOWth factor beta，TGF β)超家族是一類結(jié)構(gòu)相

2、似但功能不同的肽類物質(zhì)，在腫瘤發(fā)展中，其作用較為復(fù)雜。許多體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，。TGF β1可以抑制腎細(xì)胞癌、甲狀腺癌等進(jìn)展；部分瘤細(xì)胞由于缺乏rGF β受體，逃逸了TGF β介導(dǎo)的負(fù)性生長調(diào)節(jié)作用，最終促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展。然而在乳腺癌中，高水平的TGFβl卻可促進(jìn)其浸潤與轉(zhuǎn)移；同樣，轉(zhuǎn)染TGFβl反義寡核苷酸表達(dá)質(zhì)?？山档徒Y(jié)腸癌細(xì)胞株的致瘤性。由此可見，TGF β在腫瘤發(fā)展過程中的作用尚沒有完全明確，我們推測(cè)，對(duì)于不同類型的腫瘤甚至不同的瘤細(xì)

3、胞株而言，TGF β可能發(fā)揮不同甚至相反的生物學(xué)效應(yīng)，具體機(jī)制未明。 胃癌是一種常見的惡性腫瘤，在我國，其死亡率居各種惡性腫瘤之首。胃癌患者的主要死因?yàn)槟[瘤病灶的浸潤及轉(zhuǎn)移。近年的研究表明在胃癌組織中TGFβ1的表達(dá)水平比正常胃粘膜高，且與胃癌的浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，許多臨床資料亦顯示胃癌患者血清中TGFβl的水平升高，并與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，預(yù)示著腫瘤復(fù)發(fā)的高風(fēng)險(xiǎn)。但是，迄今為止，TGFβ1對(duì)胃癌

4、浸潤、轉(zhuǎn)移的確切影響及可能的作用機(jī)制尚未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究利用胃癌細(xì)胞．株通過裸鼠成瘤等實(shí)驗(yàn)初步探討了TGFβl對(duì)胃癌細(xì)胞浸潤與轉(zhuǎn)移的直接影響及可能的作用機(jī)制。 用10ng／ml的TGF β1處理胃癌細(xì)胞株SGC-7901、BGC-823、MKN-28，觀察處理前后各細(xì)胞株浸潤能力的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β1可明顯的促進(jìn)SGC-7901、BGC-823細(xì)胞的浸潤，而對(duì)MKN-28細(xì)胞(TGFβl抗性細(xì)胞株)沒有影響。同時(shí)將

5、經(jīng)TGFβl處理及未處理的三株細(xì)胞分別接種裸鼠(腹腔注射)，建立癌細(xì)胞裸鼠轉(zhuǎn)移模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)10ng／mlTGFβ1處理的SGC-7901、BGC-823細(xì)胞株的裸鼠，分別于7.3±2.2天及10.8±1.9天出現(xiàn)體重降低，而未處理組則分別于13.0±3.5天及15.6+2.6天出現(xiàn)體重降低，處理組體重降低時(shí)間明顯提前；同時(shí)肝轉(zhuǎn)移灶明顯比未處理組多(SGC-7901組為11.0+3.0 vs 53.3±3.3；BGC-823組為9.3

6、±2.5 vs 60.0+2.8；P<0.05)。但在MKN28組中，出現(xiàn)體重降低的時(shí)間(分別為12.6±1.8天及14.8+2.5天)及肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)量(35.2±3.8 vs 38.5±2.7;P>0.05)均無明顯差別。所以我們認(rèn)為高水平的TGFβ1可顯著促進(jìn)胃癌的浸潤與轉(zhuǎn)移。 有文獻(xiàn)報(bào)道，影響瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移的因素主要有瘤細(xì)胞粘附與水解基質(zhì)的能力、遷移能力以及粘附內(nèi)皮的能力。為進(jìn)一步探討TGFβ1促進(jìn)胃癌浸潤與轉(zhuǎn)移的機(jī)制，我

7、們分別從瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、粘附(基質(zhì)與內(nèi)皮)以及水解基質(zhì)的能力等幾個(gè)方面探討了TGFβ1對(duì)胃癌細(xì)胞的影響。結(jié)果表明，SGC-7901、BGC-823細(xì)胞經(jīng)10ng／ml TGFβ1處理后，其遷移能力與粘附基質(zhì)及內(nèi)皮細(xì)胞的能力明顯增加(P<0.05)，而處理后的MKN-28細(xì)胞則無明顯改變(P>0.05)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，SGC-7901、BGC-823細(xì)胞均有穩(wěn)定的MMP-9，MMP-2的表達(dá)，經(jīng)TGFβ1處理后其表達(dá)水平均明顯增高(P<0

8、.05)；而MKN-28細(xì)胞經(jīng)處理后其MMP-9，MMP-2的表達(dá)未見明顯變化。上述結(jié)果提示，TGFβ1是一種重要的促胃癌浸潤與轉(zhuǎn)移的細(xì)胞因子，其作用機(jī)制可能與增強(qiáng)瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、粘附以及水解基質(zhì)的能力有關(guān)。 為了系統(tǒng)探討TGFβ1對(duì)胃癌細(xì)胞影響的分子機(jī)制，我們以SGC-7901細(xì)胞為對(duì)象，利用經(jīng)典的高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，即二維凝膠電泳、基質(zhì)輔助的激光解析離子化質(zhì)譜和生物信息學(xué)技術(shù)，分析經(jīng)TGFβ1預(yù)處理的SGC-7901細(xì)胞和未

9、處理的SGC-7901細(xì)胞的差異蛋白表達(dá)譜。 通過雙向凝膠電泳分別分離TGFβ1預(yù)處理的SGC-7901細(xì)胞和未處理SGC-7901細(xì)胞的總蛋白質(zhì)，測(cè)得兩組細(xì)胞的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)分別為860±35和780±40個(gè)；位置重復(fù)性分析表明TGFβ1預(yù)處理的SGC-7901細(xì)胞在等電聚焦(IEF)方向上的平均偏差為0.958±0.112mm，在垂直板SDS-PAGE電泳方向上的平均位置偏差為1.012±0.118mm；未處理SGC-7901

10、細(xì)胞在IEF方向上的平均偏差為0.858±O.126 mm，在垂直板SDS.PAGE電泳方向上的平均位置偏差為1.045±0.148mm。以上結(jié)果表明我們成功地建立了分辨率較高，重復(fù)性較好的TGF-β1預(yù)處理的SGC-7901細(xì)胞和未處理SGC-790l細(xì)胞的二維凝膠電泳圖譜。 將TGFβ1預(yù)處理的SGC-7901細(xì)胞和未處理的SGC-7901細(xì)胞2D凝膠圖譜上的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行匹配分析,平均匹配點(diǎn)數(shù)為592±18個(gè),與未處理的SG

11、C-7901細(xì)胞相比,在FGFβ1預(yù)處理的SGC-7901細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn)23個(gè),表達(dá)下調(diào)的10個(gè)。隨機(jī)選取3個(gè)蛋白質(zhì)差異點(diǎn),凝膠內(nèi)原位酶解后,將經(jīng)MALDI-TOF質(zhì)譜分析獲得的肽質(zhì)量指紋圖(PMF)搜索MS數(shù)據(jù)庫,成功鑒定HSP-27、GST-π、coillinl等三種蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)組結(jié)果表明,體外TGFβ1可上調(diào)HSP-27、GST-π、cofilinl的表達(dá)。為進(jìn)一步探討在體條件下,這些蛋白與胃癌浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系

12、,我們利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了它們?cè)谖赴┎∪酥械谋磉_(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與無轉(zhuǎn)移的胃癌組織相比,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織及淋巴結(jié)內(nèi)轉(zhuǎn)移灶中HSP-27、GST-π、cofilinl的表達(dá)水平皆明顯升高(P<0.05),而淋巴結(jié)內(nèi)轉(zhuǎn)移灶與其相應(yīng)的原發(fā)灶的蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差異(P>0.05);同時(shí),HSP-27、GST-π、cofilinl的表達(dá)與TGFβ1的表達(dá)成正相關(guān)。上述結(jié)果提示,HSP-27、GST-π、coillinl可能參與了