T-型鈣通道對宮頸癌細(xì)胞增殖影響機制的研究.pdf

1、宮頸癌在全球女性中是第二位常見的惡性腫瘤,且80％在發(fā)展中國家。我國每年新發(fā)病例約在11萬以上,約2～3萬婦女死于該病,其發(fā)病機理尚不明確。目前HPV感染被公認(rèn)是引起宮頸癌的必要條件,但不是充分條件。HPV的終身感染率累積可高達(dá)60％～70％,但僅2～3％的女性最終發(fā)展成為宮頸癌。提示有其他輔助因素共同參與宮頸癌發(fā)病病理機制。近年研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生伴有分子和基因的改變,還可能伴有離子通道的變化。因此,對離子通道的研究已引起學(xué)者們的高

2、度重視。
　　 細(xì)胞內(nèi)鈣的調(diào)節(jié)是細(xì)胞增殖的重要信號機制之一。在癌細(xì)胞的細(xì)胞周期中,DNA合成及有絲分裂同樣需要一定的Ca2+濃度用以完成快速增殖過程。T-型鈣通道具有獨特的激活、失活特性在多種腫瘤組織細(xì)胞中表達(dá),且T型鈣通道在某些癌細(xì)胞中的表達(dá)依賴于細(xì)胞的增殖狀態(tài)。應(yīng)用T-型鈣通道阻滯劑及小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)干擾α1亞單位的功能后,細(xì)胞的增殖活性下降。因T型鈣通道在上皮組織中不表

3、達(dá),故選擇性的阻斷T型鈣通道有望成為阻止腫瘤生長治療某些腫瘤的有效方式。
　　 T-型鈣通道在某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,但它與婦科腫瘤發(fā)生的關(guān)系以及對婦科腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚未見報道。本課題從研究T-型鈣通道在正常子宮頸組織和癌組織中表達(dá)入手,利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)抑制宮頸癌Siha細(xì)胞株中T-型鈣通道(Cav3.1,Cav3.2)的表達(dá),并運用免疫組化、Real-TimeRT-PCR、流式細(xì)胞儀、及該通道的

4、各種阻滯劑,免疫熒光等技術(shù)研究T-型鈣通道在宮頸癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期中的作用及該通道對細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)的可能機制。
　　 本課題共分三部分:1、T型鈣通道在宮頸癌組織細(xì)胞中表達(dá)；2、T型鈣通道對宮頸癌Siha細(xì)胞增殖及對細(xì)胞周期的影響；3、T型鈣通道阻滯劑抑制人宮頸癌Siha細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的研究。
　　 第一部分、T型鈣通道在宮頸癌組織中表達(dá)目的檢測人的正常子宮頸和宮頸癌組織中T型鈣通道Cav3.1,Cav3.2的表達(dá),

5、研究它與宮頸癌的關(guān)系。
　　 方法：應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)Real-Time RT-PCR(q-RT-PCR)檢測正常宮頸和宮頸癌組織中Cav3.1,Cav3.2 mRNA的表達(dá),免疫組織化學(xué)檢測正常宮頸和宮頸癌組織中Cav3.1,CaLv3.2通道蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：12例正常子宮頸標(biāo)本組織中10例Cav3.1,Cav3.2mRNA弱表達(dá)或不表達(dá)僅有2例中等表達(dá);而25例宮頸癌標(biāo)本組織都表達(dá)Cav3.1,Cav3

6、.2mRNA。宮頸癌組織和正常子宮頸組織Cav3.1,Cav3.2mRNA表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);12例正常子宮頸標(biāo)本組織中僅有3例弱表達(dá)Cav3.1蛋白,4例弱表達(dá)Cav3-2蛋白,而25例宮頸癌標(biāo)本組織都表達(dá)Cav3.1,Cav3.2蛋白。宮頸癌組織和正常子宮頸組織Cav3.1,Cav3.2蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。免疫組化和Real-TimePCR結(jié)果基本一致。
　　 結(jié)論：T型鈣通道(C

7、av3.1,Cav3.2)的過表達(dá)可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。
　　 第二部分、T型鈣通道對宮頸癌Siha細(xì)胞生長及其對細(xì)胞周期的影響目的探討T型鈣通道Cav3.1,Cav3.2對宮頸癌細(xì)胞生長調(diào)節(jié)作用及其可能機制。
　　 方法：選擇高表達(dá)T型鈣通道Cav3.1,Cav3.2的宮頸癌Siha細(xì)胞株作為研究對象。①檢測不同濃度、不同種類阻滯劑和siRNA技術(shù)對Siha細(xì)胞增殖的影響。②針對T型鈣通道Cav3.1,Cav3.

8、2設(shè)計一對特異性siRNA和一對陰性對照siRNA(scrarnbled-silencing)。用RNAi干擾宮頸癌細(xì)胞中Cav3.1,Cav3.2基因的表達(dá),用FAM標(biāo)記的siRNA檢測轉(zhuǎn)染效率和Western blotting檢測干擾效率。③采用免疫熒光,流式細(xì)胞儀,細(xì)胞計數(shù)等方法了解特異性抑制Cav3.1,Cav3.2通道的表達(dá)和阻滯劑阻斷Cav3.1,Cav3.2通道后對Siha細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。④在特異性抑制T型鈣通道

9、Cav3.1,Cav3.2的表達(dá)和阻滯劑阻斷T型鈣通道Cav3.1,Cav3.2條件下,利用免疫熒光,Western blotting技術(shù)檢測與細(xì)胞周期密切相關(guān)的CyclinD1,Cyclin E蛋白的表達(dá),初步探討T型鈣通道Cav3.1,Cav3.2調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的可能機制。
　　 結(jié)果：針對T型鈣通道Cav3.1/3.2的siRNA抑制了宮頸癌Siha細(xì)胞中Cav3.1/3.2通道的表達(dá);siRNA特異并有效地抑制Siha細(xì)胞

10、中T型鈣通道的表達(dá),使細(xì)胞增殖減少(P＜0.01),并使細(xì)胞周期阻滯在G0-G1期,S期減少(P＜0.01);特異性阻滯劑NNC55-0396,呈時間依賴的方式抑制Siha細(xì)胞的增殖;NNC55-0396,mibefradil呈劑量依賴的方式抑制Siha細(xì)胞的增殖;NNC55-0396,mibefradil呈劑量依賴的方式使細(xì)胞周期阻滯于G0-G1期,S期減少;特異性抑制T型鈣通道Cav3.1/3.2的表達(dá)和阻滯劑阻斷T型鈣通道后,細(xì)胞

11、周期蛋白Cyclin D1,Cyclin E表達(dá)下調(diào)。
　　 結(jié)論：①T型鈣通道Cav3.1,Cav3.2在宮頸癌Siha細(xì)胞中功能性表達(dá)。②T型鈣通道Cav3.1,Cav3.2參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié),其可能機制是調(diào)節(jié)Cyclin D1,Cyclin E蛋白的表達(dá)水平,使細(xì)胞通過G0-G1期進入S期,也有可能通過其它機制調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期,T型鈣通道Cav3.1,Cav3.2可作為宮頸癌組織惡性轉(zhuǎn)化的標(biāo)志物和宮頸癌放

12、化療的靶點。
　　 第三部分、T型鈣通道阻滯劑抑制人宮頸癌Siha細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的研究目的進一步探討T型鈣通道Cav3.1,Cav3.2在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 方法：該試驗用18只BAL B/c裸鼠,隨機分為研究組和對照組,每組9只。兩組裸鼠均皮下注射Siha細(xì)胞5×106/只,治療組加入T型鈣通道阻滯劑NNC55-0396,使其最終濃度為20μM,對照組加入相同體積的DMEM無血清培養(yǎng)液(用來溶解NNC5

13、5-0396,為0.3ml)。觀察裸鼠的一般情況,每七天測量腫瘤的體積,在第21天處死裸鼠,測量腫瘤的體積和重量。
　　 結(jié)果：兩組裸鼠一般情況無差異性變化;在接種第7、14、21天,對照組和治療組腫瘤體積為(meana±SD;mm3):189.3±26.7 versus146.3±22.9(P＜0.01);327.8±76.0versus203.5±43.5(P＜0.01);803.7±187.2 versus348.8±12

14、7.0(P＜0.01);對照組和治療組腫瘤重量為0.74±0.25g versus0.40±0.07g(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：T型鈣通道Cav3.1,Car3.2在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用,可能成為治療宮頸癌的新靶點。
　　 小結(jié)：T型鈣通道在宮頸癌組織中過度表達(dá),調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期。本研究還研究了T型鈣通道Cav3.1,Cav3.2在宮頸癌Siha細(xì)胞株中的特性,初步探討了T型鈣通道Cav3.