不同溫度熱療對(duì)人宮頸癌細(xì)胞凋亡和增殖的影響.pdf

1、研究背景宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，與高危型HPV感染直接相關(guān)，近年來(lái)發(fā)病率呈上升和年輕化的趨勢(shì)。晚期宮頸癌以放化療為主。由于放化療抵抗以及放化療的毒性反應(yīng)，晚期宮頸癌的5年生存率為50％左右。熱療引起細(xì)胞凋亡和壞死，同時(shí)具有放化療增敏優(yōu)勢(shì)，在宮頸癌的綜合治療中提高了5年生存率和局部控制率，而遠(yuǎn)期毒性反應(yīng)沒(méi)有增加。 熱療對(duì)宮頸癌的作用機(jī)制尚不清楚。傳統(tǒng)的熱療認(rèn)為43℃是大多數(shù)細(xì)胞發(fā)生凋亡的臨界點(diǎn)，但近期研究發(fā)現(xiàn)，4

2、3℃熱療并不是對(duì)所有種類(lèi)的癌細(xì)胞均具有殺傷作用。細(xì)胞對(duì)熱療的敏感性與細(xì)胞的種類(lèi)和基因特征有關(guān)。探索不同細(xì)胞株對(duì)熱療的敏感性有助于臨床個(gè)體化的熱療方案。 磁熱療是一種新興的熱療手段，與傳統(tǒng)的熱療方式相比具有靶向定位升溫的優(yōu)勢(shì)，而對(duì)周?chē)＝M織的損傷小，在國(guó)外的前列腺癌等Ⅱ期臨床試驗(yàn)中顯示較好的療效，但是對(duì)宮頸癌的研究未見(jiàn)報(bào)道。 因此，我們采用不同溫度體內(nèi)外加熱宮頸癌細(xì)胞，探討不同溫度熱療對(duì)細(xì)胞凋亡和增殖的影響，以及凋亡的內(nèi)

3、在作用機(jī)制，為熱療在宮頸癌的臨床運(yùn)用提供部分理論依據(jù)。 第一章不同溫度熱療對(duì)宮頸癌Caski細(xì)胞凋亡和增殖的影響 目的：探討不同溫度熱療對(duì)宮頸癌Caski細(xì)胞凋亡、增殖以及細(xì)胞周期的影響。 方法：采用水浴對(duì)宮頸癌Caski細(xì)胞行43℃、45℃、47℃實(shí)驗(yàn)組和37℃對(duì)照組熱療，四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率、壞死率和細(xì)胞周期的變化，免疫組化檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)。

4、 結(jié)果：45℃，47℃組的細(xì)胞增殖抑制率在24h、48h、72h、96h分別為76.11±5.32％、81.08±4.03％、74.71±3.78％、72.16±4.75％和88.57±3.77％、91.33±2.43％、91.09±1.17％、92.05±1.67％，明顯高于43℃組的26.57±3.46％、25.49±2.76％、22.80±3.16％、26.87±4.01％（P<0.05）。45℃與47℃組的細(xì)胞增殖抑制率

5、之間的差異無(wú)顯著性（P>0.05）。45℃組的細(xì)胞凋亡率最高，為12.82±1.77％，與其它各組之間的差異具有顯著性（P<0.05）。47℃組的細(xì)胞壞死率最高，為39.15±5.67％，各組之間的差異均有顯著性（P<0.05）。43℃、45℃、47℃組的G1期細(xì)胞比對(duì)照組明顯減少（P<0.05），而S期細(xì)胞明顯增加（P<0.05）。PCNA的表達(dá)隨著熱療溫度的增加而降低。45℃，47℃組的平均光密度值（AOD）分別是0.228±0.0

6、22、0.214±0.018，與對(duì)照組和43℃相比差異具有顯著性（P<0.05）。 結(jié)論：45℃及以上的熱療能夠明顯抑制Caski細(xì)胞的增殖，增加凋亡率和壞死率，細(xì)胞周期阻滯在S期，降低PCNA的表達(dá)。 第二章熱療誘導(dǎo)Smac/DIABLO表達(dá)促進(jìn)Caski細(xì)胞凋亡 目的：研究宮頸癌Caski細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同溫度熱療后凋亡相關(guān)基因p53、Smac/DIABLO、survivin、caspase-3的表達(dá)變化。

7、 方法：采用水浴對(duì)宮頸癌Caski細(xì)胞行43℃、45℃、47℃熱療40min，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同溫度熱療后繼續(xù)培養(yǎng)2h、6h、12h、24h HPV16E6、p53、Smac/DIABLO、survivin、caspase-3在mRNA水平的表達(dá)變化。Western Blotting檢測(cè)不同溫度熱療后2h、6h、12h、24h Smac/DIABLO、survivin、caspase-3在蛋白水平的表達(dá)變化。免疫組化檢測(cè)不同溫度

8、熱療后24h caspase-3蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)變化。 結(jié)果：（1）43℃熱療后各時(shí)間點(diǎn)HPV16E6、Smac/DIABLO、survivin、caspase-3 mRNA的表達(dá)均比對(duì)照組增加（p<0.05）。與對(duì)照組相比，43℃熱療后2h出現(xiàn)survivin蛋白的表達(dá)降低，其后survivin蛋白的表達(dá)反而上調(diào)（P<0.05）。43℃熱療后6h和24h Smac/DIABLO蛋白的表達(dá)明顯增加（P<0.05）；而caspa

9、se-3蛋白表達(dá)增加出現(xiàn)在熱療后12-24h（P<0.05）。（2）45℃熱療后各時(shí)間點(diǎn)HPV16E6 mRNA、survivin mRNA和蛋白的表達(dá)比對(duì)照組降低（P<0.05）。45℃熱療后12-24h Smac/DIABLO和caspase-3 mRNA的表達(dá)比對(duì)照組明顯增加（P<0.05）。45℃熱療后6h Smac/DIABLO和caspase-3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，并維持至熱療后24h（P<0.05）。（3）47℃熱療后各時(shí)間

10、點(diǎn)HPV16E6、Smac/DIABLO、survivin mRNA的表達(dá)均比對(duì)照組明顯降低（P<0.05）；而caspase-3 mRNA在熱療后24h比對(duì)照組增加（P<0.05）。47℃熱療后2h Smac/DIABLO蛋白的表達(dá)和2-6hcaspase-3蛋白的表達(dá)比對(duì)照組明顯增加（P<0.05），之后兩者的表達(dá)明顯低于對(duì)照組（P<0.05）。47℃熱療后在各時(shí)間點(diǎn)survivin蛋白的表達(dá)顯著降低甚至缺失（P<0.05）。（4）

11、43℃、45℃和47℃熱療后野生型p53 mRNA的表達(dá)比對(duì)照組明顯減少（P<0.05）。（5）43℃和45℃熱療后24h caspase-3的AOD值比37℃和47℃明顯增加（P<0.05）。而45℃和47℃熱療后caspase-3的核陽(yáng)性指數(shù)增加，與37℃和43℃相比，差異具有顯著性（P<0.05）。 結(jié)論：宮頸癌Caski細(xì)胞中Smac/DIABLO、survivn和caspase-3在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化與熱療溫

12、度和培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)。45℃以上的熱療抑制HPV16E6 mRNA的表達(dá)。熱療后Smac/DIABLO通路誘導(dǎo)的Caski細(xì)胞凋亡可能不依賴于野生型p53基因的調(diào)控。熱療后caspase-3從細(xì)胞漿易位至細(xì)胞核是細(xì)胞凋亡的重要事件。 第三章不同溫度磁熱療對(duì)人宮頸癌裸鼠皮下移植瘤的影響 目的：探討不同溫度磁熱療對(duì)人宮頸癌裸鼠皮下移植瘤的作用。 方法：用人宮頸癌Hela細(xì)胞株建立裸鼠皮下移植瘤模型，將Fe3O4磁性納米顆

13、粒直接注入腫瘤組織內(nèi)，在交變磁場(chǎng)中進(jìn)行磁感應(yīng)加熱治療，分別控溫在43℃和47℃持續(xù)30min，3天后重復(fù)加熱一次，比較43℃組磁熱療組（43℃MFH）、47℃磁熱療組（47℃MFH）、單純磁流體組（MF組）、生理鹽水（NS組）和對(duì)照組的腫瘤體積的大小、腫瘤體積抑制率、生存期和PCNA的陽(yáng)性指數(shù)。 結(jié)果：熱療后的第1-4周47℃MFH組的腫瘤體積抑制率分別為47.05％、89.21％、88.55％、87.19％；43℃MFH組的分

14、別為32.26％、52.64％、48.84％、38.42％。與對(duì)照組相比，43℃MFH組和47℃MFH組均能抑制腫瘤的生長(zhǎng)（P<0.05）。與43℃MFH組比較，47℃MFH組抑瘤作用更顯著，有33.33％的腫瘤消退率（P<0.05）。43℃MFH組和47℃MFH組的生存期分別為36.67±1.28d、49.33±3.19d，比對(duì)照組的27.33±1.41d明顯延長(zhǎng)（P<0.05）。而47℃MFH組與43℃MFH組的生存期之間的差異亦具