核受體FXR抑制人肝癌細(xì)胞增殖機(jī)制及其臨床意義的研究.pdf

1、目的：
　　檢測(cè)法呢醇X受體(Farnesoid X Receptor,FXR)在人肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)組織中的表達(dá)情況，并通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)探討FXR對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響及其可能的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.人體肝癌組織中FXR及其靶基因和增殖相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)：
　?。?）Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)45例肝細(xì)胞癌及配對(duì)的癌旁組織，和13例正常肝組織中

2、FXR mRNA和FXR靶基因SHPmRNA的表達(dá)，并將這45例肝癌組織中FXR mRNA和SHP mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析。
　?。?）免疫組化技術(shù)檢測(cè)100例人HCC患者肝癌組織、配對(duì)的癌旁組織和20例正常肝組織FXR蛋白和SHP蛋白的表達(dá)。
　?。?）Real time PCR技術(shù)檢測(cè)21例肝細(xì)胞癌組織和配對(duì)的癌旁組織中FXR下游膽酸代謝相關(guān)靶基因CYP7A1、BSEP以及增殖相關(guān)基因cyclinD1、cycl

3、inE的mRNA表達(dá)。
　　2.慢病毒載體介導(dǎo)的FXR基因過表達(dá)對(duì)人肝癌細(xì)胞株增殖的影響：
　　（1）構(gòu)建FXR過表達(dá)的慢病毒載體LV-FXR-GFP和對(duì)照空載體LV-GFP。
　　（2）慢病毒載體LV-FXR-GFP轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，鑒定FXR蛋白和mRNA的過表達(dá)情況，并利用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)FXR下游靶基因的SHP、CYP7A1、BSEP和增殖相關(guān)基因cyclinD1、cyclinE mRNA的

4、表達(dá)變化；利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)FXR、SHP和Ki67蛋白的表達(dá)；利用WST-1法檢測(cè)HepG2細(xì)胞增殖情況，并繪制生長(zhǎng)曲線，研究FXR基因過表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞體外增殖能力的影響。
　　3.FXR基因過表達(dá)對(duì)裸鼠腫瘤增殖的影響：
　?。?）用構(gòu)建的慢病毒載體LV-FXR-GFP（FXR過表達(dá)組）和LV-GFP（對(duì)照組）感染HepG2細(xì)胞，并分別將兩組細(xì)胞接種于裸鼠皮下，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線；
　?。?）

5、檢測(cè)兩組移植瘤組織中FXR、SHP、cyclinD1、cyclinE mRNA表達(dá)情況，和FXR、SHP、Ki67蛋白表達(dá)情況，探討FXR基因過表達(dá)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)增殖的影響。
　　結(jié)果：
　　1.FXR及下游靶基因和增殖相關(guān)基因在人HCC組織中的異常表達(dá)：
　　（1）HCC組織中FXR mRNA和FXR蛋白表達(dá)水平明顯低于配對(duì)的癌旁組織和正常人肝組織。正常組織FXR mRNA表達(dá)量是肝癌組織的3.62倍

6、（P<0.05），而癌旁肝組織FXR mRNA的表達(dá)量是肝癌組織的2.65倍（P<0.05）。FXR蛋白在肝癌組織陽性表達(dá)率（18％）明顯低于配對(duì)的癌旁組織（80%）和正常肝組織（85%），P<0.05。
　?。?）HCC組織中SHP mRNA和SHP蛋白的表達(dá)水平明顯低于配對(duì)的癌旁組織和正常人肝組織。正常組織SHP mRNA的表達(dá)量是肝癌組織的9.59倍（P<0.05），癌旁肝組織SHP mRNA的表達(dá)量是肝癌組織的7.36倍（

7、P<0.05）。SHP蛋白在肝癌組織的陽性表達(dá)率（15%）明顯低于癌旁組織（77%）和正常肝組織（80%），P<0.05。FXR mRNA和SHP mRNA在人肝癌組織中的表達(dá)呈明顯正相關(guān)性，P=0.003.
　　（3）21例HCC患者中，12例（57%）肝癌組織內(nèi)CYP7A1 mRNA表達(dá)水平低于癌旁肝組織，其余9例（43%）肝癌組織內(nèi)CYP7A1 mRNA表達(dá)上調(diào)。21例HCC患者癌旁組織BSEP表達(dá)水平均明顯高于肝癌組織，是

8、肝癌組織的5.568倍，P<0.05。
　?。?）21例HCC患者中，16例（76.2%）肝癌組織cyclinD1 mRNA表達(dá)低于癌旁肝組織，但P=0.364，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?。?）21例HCC患者中，15例（71.4%）肝癌組織中CyclinE mRNA表達(dá)高于癌旁肝組織，肝癌組織CyclinE mRNA表達(dá)量是癌旁組織的4.4295倍，P=0.026。
　　2.慢病毒載體LV-FXR-GFP轉(zhuǎn)染肝癌Hep

9、G2細(xì)胞后，F(xiàn)XR mRNA和FXR蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，HepG2細(xì)胞體外增殖速度明顯減慢。隨著FXR表達(dá)水平的升高，F(xiàn)XR下游靶基因SHP和BSEP表達(dá)上調(diào)，CYP7A1表達(dá)下調(diào)；增殖相關(guān)基因cyclinD1、cyclinE、Ki-67表達(dá)下調(diào)。
　　3.FXR過表達(dá)明顯抑制裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)下游靶基因SHP表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞增殖相關(guān)基因cyclinD1、cyclinE、Ki-67表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　FX