let-7c對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制.pdf

1、碩士學(xué)位論文let一7c對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制EffeCtandmeChanismofProliferationofhePatocellularCellSlet一7ConCafCino們na系:中山醫(yī)院業(yè):內(nèi)科學(xué)院專碩士研究生:公方曉導(dǎo)師:夏景林教授導(dǎo)師組成員:楊畢偉主治醫(yī)師陳榮新主治醫(yī)師二零一一年四月碩士學(xué)位論文中文摘要背景和目的Micr0RNA(miRNA)是一種約22個(gè)核普酸長(zhǎng)度的小分子單鏈RNA。在腫瘤中，與周圍正常組織相

2、比，一些miRNA發(fā)生異常表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)這些異常表達(dá)的miRNA能影響腫瘤的增殖、分化、凋亡、侵襲等生物學(xué)行為。let一7家族最早被發(fā)現(xiàn)在肺癌細(xì)胞中表達(dá)下降，能通過調(diào)控靶基因RAS等來抑制肺癌細(xì)胞的增殖。但let一7對(duì)肝癌細(xì)胞的作用有待研究，而且其新的靶點(diǎn)尚需揭示。本研究著力于探討人源性let一7c(hsa一let一7c)對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖的影響，并揭示其新的靶基因。方法選取人肝癌細(xì)胞系HCCLM3，用llpofectamine2000脂

3、質(zhì)體做為載體將miRNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。研究設(shè)三組，let一7c組為轉(zhuǎn)染了let一7c的癌細(xì)胞，對(duì)照組為轉(zhuǎn)染了陰性對(duì)照miRNA的癌細(xì)胞，空白組為未轉(zhuǎn)染任何試劑的癌細(xì)胞。CCK一8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖生長(zhǎng)情況用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期的分布差異利用生物信息學(xué)網(wǎng)站查找出let一7c的潛在靶基因eyelinDI、eyelinnZ、enK6westemblot驗(yàn)證各組細(xì)胞cyelinDI、eyelinDZ、CDK6蛋白的表達(dá)差異實(shí)時(shí)熒光pCR驗(yàn)證

4、各組eyclinDl、eDK6mRNA的表達(dá)差異構(gòu)建含cyelin01、enK6的3’UTR的熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證let一7c對(duì)3’UTR的直接結(jié)合作用。結(jié)果1.CCK一8法檢測(cè)各組HCCLM3細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h、48h、72h、96h的吸光度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)24h時(shí)，各組細(xì)胞吸光度無差異(P0.05)，而48h、72h、96h各時(shí)間點(diǎn)let一7c組吸光度均低于空白組與對(duì)照組(P值均0.05)。2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后72h各組細(xì)胞周期的分布情況

5、，結(jié)果let一7c組細(xì)胞分布在Gl期的細(xì)胞百分比為54.52%士0.13%，空白組的比例為43.53%士0.86%，對(duì)照組為44.82%士0.77%。let一7c組的G，期細(xì)胞比例高于空白組與對(duì)照組，差異明顯(P值均0.05)。3.查找TargetScan、PicTar等生物學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)站，預(yù)測(cè)Iet一7c新的靶基因cyclinDI、eyelinDZ、CDK6。4.Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，Iet一7e組cyelinDI、eyel