Hsa-let-7g抑制肝癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制研究和斑馬魚(yú)肝癌研究模型的建立.pdf

1、原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，約占原發(fā)性肝癌的百分之九十。其發(fā)病隱匿、早期診斷困難、易復(fù)發(fā)、預(yù)后差、死亡率高。MircoRNA是一類(lèi)存在于真核生物中長(zhǎng)約22 nt的非編碼、具調(diào)控功能的單鏈小分子RNA，參與生命過(guò)程中一系列重要的進(jìn)程，包括個(gè)體發(fā)育、器官形成、細(xì)胞增殖與死亡、神經(jīng)細(xì)胞和干細(xì)胞等細(xì)胞的分化、造血生成、脂肪等物質(zhì)代謝、激素分泌、腫瘤形成等生物學(xué)過(guò)程。近期研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在不同肝癌細(xì)胞株和不同國(guó)家或不同地區(qū)的肝

2、癌組織中異常表達(dá)，表明miRNA可能參與了肝細(xì)胞癌變的過(guò)程。已證實(shí)的miRNA在HCC中的靶基因包括參與蛋白質(zhì)合成與水解、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、分化與凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄、物質(zhì)代謝等生物生命進(jìn)程中的多個(gè)基因，涉及到腫瘤發(fā)生發(fā)展的很多方面。因此，對(duì)HCC相關(guān)的miRNA進(jìn)行深入研究是非常有必要的。
　　 由于原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌已成為危害人類(lèi)生命健康的主要腫瘤之一，多年來(lái)人們一直在探索治療原發(fā)性肝癌的新方法，不斷研制新藥物。因此，建立體

3、內(nèi)動(dòng)物模型研究HCC的發(fā)生發(fā)展及篩選治療HCC的藥物不僅是十分必要的，而且需要不斷探索更好更有效的體內(nèi)肝癌研究模型。斑馬魚(yú)是近年來(lái)興起的體內(nèi)動(dòng)物研究模型，自然界中斑馬魚(yú)組織器官的癌變與人類(lèi)極為相似，這為斑馬魚(yú)在體內(nèi)研究人類(lèi)腫瘤發(fā)展提供了很好的基礎(chǔ)。由于斑馬魚(yú)腫瘤模型相對(duì)于大小鼠腫瘤模型擁有很多優(yōu)點(diǎn)：易于飼養(yǎng)，經(jīng)濟(jì)方便，產(chǎn)卵量高；并且胚胎透明，易于觀察癌細(xì)胞擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移、滲透和血管生成；在藥物篩選方面，斑馬魚(yú)可以有效的吸收周?chē)h(huán)境中的小分

4、子化合物，使抗癌藥物的大規(guī)模篩選簡(jiǎn)便易行。
　　 本研究意在探討miRNA中的一個(gè)重要家族，let-7家族成員：hsa-let-7g在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。進(jìn)而研究hsa-let-7g在肝癌中的具體生物學(xué)功能，為miRNA在臨床診斷、治療、預(yù)后評(píng)估及應(yīng)用于臨床的肝癌治療奠定理論基礎(chǔ)。本研究同時(shí)建立了斑馬魚(yú)肝癌體內(nèi)研究模型，為在體內(nèi)研究miRNA及肝癌的發(fā)生發(fā)展和篩選抗肝癌藥物建立新的體內(nèi)研究模型奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 主要

5、研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　 第一章、Hsa-let-7g在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)特征
　　 經(jīng)qPCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與人正常肝細(xì)胞LO2相比，hsa-let-7g在人肝癌細(xì)胞HepG2，、Hep3B和Huh7中呈明顯低表達(dá)狀態(tài)，而在Bel-7404細(xì)胞株中表現(xiàn)為高表達(dá)。
　　 第二章、Hsa-let-7g靶基因的預(yù)測(cè)及作用位點(diǎn)檢測(cè)
　　 1.Hsa-let-7g靶基因的預(yù)測(cè)
　　 經(jīng)過(guò)查找Ensembl

6、e Genome Brower database，發(fā)現(xiàn)hsa-let-7g基因以反義鏈的形式存在于第3號(hào)染色體。為研究hsa-let-7g在人肝癌細(xì)胞中的功能，我們對(duì)hsa-let-7g的靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)。發(fā)現(xiàn)原癌基因c-Myc mRNA的3'UTR區(qū)域一第138-147位堿基與hsa-let-7g的seed區(qū)域有很好的匹配，并且該seed區(qū)域在人、牛、豬、大鼠、小鼠及非洲爪蟾6個(gè)物種中高度保守。經(jīng)過(guò)在Ensemble Genome B

7、rower database中序列比對(duì)分析，hsa-let-7g的成熟序列及其前體序列在24個(gè)物種中高度保守。
　　 2.Hsa-let-7g作用位點(diǎn)檢測(cè)
　　 綜合預(yù)測(cè)的結(jié)果，我們將與hsa-let-7g的seed區(qū)域相結(jié)合的c-Myc3'UTR作用位點(diǎn)及作用位點(diǎn)堿基突變的片段克隆到psiCHECK2質(zhì)粒上，構(gòu)建了含hsa-let-7g作用位點(diǎn)的c-Myc3'UTR熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)載體，并同時(shí)構(gòu)建了其作用位點(diǎn)突變的載體

8、作為陰性對(duì)照。有研究表明，hsa-let-7g可以與N-Ras基因mRNA的3'UTR相結(jié)合，調(diào)控N-Ras基因的轉(zhuǎn)錄后翻譯。因此，我們將與hsa-let-7g相結(jié)合的N-ras3'UTR作用位點(diǎn)克隆到psiCHECK2質(zhì)粒，構(gòu)建含hsa-let-7g作用位點(diǎn)的N-ras3'UTR熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)載體作為陽(yáng)性對(duì)照。將克隆好的含有與hsa-let-7g相互作用位點(diǎn)的c-Myc3'UTR載體，、c-Myc-3'UTR作用位點(diǎn)突變載體和N-R

9、as3'UTR載體與hsa-let-7g或mimicsnegative control共轉(zhuǎn)染HepG2肝癌細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶的活性。結(jié)果顯示：只有共轉(zhuǎn)染c-Myc3'UTR+hsa-let-7g和N-Ras3'UTR+hsa-let-7g兩組的熒光素酶活性顯著下降而其他陰性對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異，從而用生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的方法證明了hsa-let-7g的seed區(qū)域與c-Myc3'UTR的第138-147位堿基相結(jié)合，即c-Myc是hsa-let

10、-7g的靶基因。
　　 第三章、Hsa-let-7g對(duì)肝癌細(xì)胞增殖作用機(jī)制的研究
　　 1.Hsa-let-7g抑制肝癌細(xì)胞的增殖
　　 根據(jù)hsa-let-7g在人肝癌中的表達(dá)模式，我們選取HepG2和Bel-7404細(xì)胞株來(lái)探討hsa-let-7g在肝癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能。由于hsa-let-7g在肝癌細(xì)胞HepG2中低表達(dá)，我們將hsa-let-7g mimics轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，分別于轉(zhuǎn)染后的Day1、

11、Day2、Day3、Day4、Day5用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖變化。轉(zhuǎn)染hsa-let-7gmimics后48 h，與對(duì)照組相比較，HepG2細(xì)胞中hsa-let-7g的水平明顯升高(p＜0.05)說(shuō)明成功地轉(zhuǎn)染hsa-let-7g mimics可以特異明顯的升高肝癌細(xì)胞HepG2中hsa-let-7g水平。從轉(zhuǎn)染后48 h開(kāi)始，hsa-let-7g mimics可以抑制肝癌HepG2的增殖，其抑制作用持續(xù)至轉(zhuǎn)染后第5天。而將hsa-l

12、et-7g inhibitor轉(zhuǎn)染hsa-let-7g高表達(dá)的Bel-7404細(xì)胞72h，與對(duì)照組相比較，Bel-7404細(xì)胞中hsa-let-7g的水平明顯降低(p＜0.05)說(shuō)明成功地轉(zhuǎn)染hsa-let-7g inhibitor可以特異明顯的降低肝癌細(xì)胞Bel-7404中hsa-let-7g水平。hsa-let-7g inhibitor將hsa-let-7g抑制后，可促進(jìn)Bel-7404的增殖，促進(jìn)增殖作用從轉(zhuǎn)染后72h開(kāi)始，持續(xù)至

13、轉(zhuǎn)染后第5天。由此結(jié)果說(shuō)明，在不同hsa-let-7g表達(dá)的肝癌細(xì)胞株中，hsa-let-7g從正反兩個(gè)方面均能調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的增殖，發(fā)揮其抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用。
　　 2.Hsa-let-7g下調(diào)原癌基因c-Myc的表達(dá)
　　 經(jīng)過(guò)預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)證明，原癌基因c-Myc是hsa-let-7g的靶基因。經(jīng)qPCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與正常肝細(xì)胞LO2相比，肝癌HepG2和Bel-7404細(xì)胞中原癌基因c-Myc的mRNA表達(dá)明顯升高了

14、至少6倍。
　　 3.Hsa-let-7g對(duì)肝癌細(xì)胞蛋白質(zhì)組表達(dá)的影響：
　　 為了進(jìn)一步研究hsa-let-7g對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的具體機(jī)制以及其對(duì)肝癌細(xì)胞蛋白質(zhì)組表達(dá)的影響，我們對(duì)轉(zhuǎn)染了hsa-let-7g mimics和mimics negative control的HepG2細(xì)胞進(jìn)行二維電泳，檢測(cè)其蛋白質(zhì)組表達(dá)變化。
　　 4.Hsa-let-7g下調(diào)原癌基因Bmi-1的表達(dá)：
　　 綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果

15、，我們發(fā)現(xiàn)hsa-let-7g通過(guò)調(diào)節(jié)原癌基因c-Myc和抑癌基因p16的表達(dá)從而調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的增殖。
　　 第四章、斑馬魚(yú)肝癌研究模型的構(gòu)建
　　 為進(jìn)一步在體內(nèi)研究hsa-let-7g及其它miRNA的功能，我們以斑馬魚(yú)為模式生物，建立了斑馬魚(yú)肝癌研究模型。將線(xiàn)性化的pcDNA3.0+DsRed質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞HepG2后，將轉(zhuǎn)染了pcDNA3.0+DsRed紅色熒光質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞用顯微注射的方法注射進(jìn)入發(fā)育

16、了2天的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)flk1：GFP幼魚(yú)的卵黃內(nèi)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射進(jìn)入幼魚(yú)的肝癌細(xì)胞能夠從斑馬魚(yú)腸下血管誘導(dǎo)血管生成，說(shuō)明人肝癌細(xì)胞在斑馬魚(yú)體內(nèi)存活，并誘導(dǎo)了斑馬魚(yú)的血管生成，斑馬魚(yú)肝癌體內(nèi)研究模型構(gòu)建成功。
　　 結(jié)論及研究意義：
　　 1.原癌基因c-Myc是hsa-let-7g的靶基因
　　 經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，let-7家族成員之一，hsa-let-7g的seed區(qū)域與c-Myc3'UTR的第138-147位堿基相

17、作用，即原癌基因c-Myc是hsa-let-7g的靶基因。
　　 2.Hsa-let-7g通過(guò)調(diào)節(jié)c-Myc-Bmi-1-p16通路抑制肝癌細(xì)胞的增殖
　　 本研究首次發(fā)現(xiàn)：在人肝癌細(xì)胞中，hsa-let-7g能夠通過(guò)直接下調(diào)原癌基因c-Myc、間接下調(diào)原癌基因Bmi-1及間接上調(diào)抑癌基因p16來(lái)抑制肝癌細(xì)胞的增殖，即hsa-let-7g參與了肝癌細(xì)胞中c-Myc-Bmi-1-p16通路的調(diào)節(jié)。
　　 3.成功建