守宮硫酸糖肽抑制肝癌細(xì)胞增殖與遷移的體外研究.pdf

1、目的：
　　臨床上，多數(shù)實(shí)體惡性腫瘤的硬度高于正常組織，軟堅(jiān)散結(jié)是中醫(yī)治療惡性腫瘤的重要方法之一。守宮硫酸糖肽是傳統(tǒng)軟堅(jiān)散結(jié)中藥守宮抗腫瘤的主要有效成份。本課題通過(guò)守宮硫酸糖肽對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的體外研究，探究守宮硫酸糖肽對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖與遷移的影響并初步探討其中的機(jī)制。
　　方法：
　　1.取肝癌HepG2細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組、GSPP低劑量組（20μg/mL）、GSPP中劑量組（100μg/mL）、G

2、SPP高劑量組（200μg/mL）。運(yùn)用MTS試驗(yàn)觀察守宮硫酸糖肽對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響，并依據(jù)不同觀察時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
　　2.取肝癌HepG2細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組同上，通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)觀察守宮硫酸糖肽對(duì) HepG2細(xì)胞遷移的影響。并通過(guò)免疫熒光法觀察不同實(shí)驗(yàn)組HepG2細(xì)胞內(nèi)E-鈣粘蛋白，Vimentin以及α-SMA表達(dá)情況。
　　3.取肝癌HepG2細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組同上，通過(guò)流式細(xì)

3、胞術(shù)檢測(cè)HepG2細(xì)胞表面整合素β1表達(dá)情況，并通過(guò)Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)E-鈣粘蛋白及p-ERK表達(dá)情況。同時(shí)，運(yùn)用RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)整合素信號(hào)通路上Rho，Rac， cdc42，Arp3蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.MTS法探究守宮硫酸糖肽對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響：分別于加藥12h，24h，36h，48h測(cè)量每組細(xì)胞的OD值。結(jié)果顯示：GSPP高中低劑量組HepG2增殖的細(xì)胞數(shù)較空白對(duì)照

4、組均明顯較少(P<0.05)，并且高劑量（200μg/mL）組對(duì)于增殖的抑制作用最強(qiáng)。
　　2.(1)劃痕實(shí)驗(yàn)：在加入藥物時(shí)和加入藥物12小時(shí)后，分別測(cè)量不同組別細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)的距離。通過(guò)觀察圖片和測(cè)量細(xì)胞遷移的距離我們可以看出，三個(gè)劑量守宮硫酸糖肽組 HepG2細(xì)胞的遷移距離與空白對(duì)照組比較，均明顯減少(P<0.01)。
　　(2)Transwell實(shí)驗(yàn)：從穿過(guò)Transwell小室膜的細(xì)胞數(shù)看，GSPP三個(gè)劑量組較空白對(duì)照

5、組細(xì)胞數(shù)均明顯減少（P<0.01）。并且這種抑制遷移的作用呈劑量依賴性。
　　(3)免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞內(nèi)E-鈣粘蛋白，Vimentin與α-SMA的表達(dá)情況：守宮硫酸糖肽三個(gè)劑量組與對(duì)照組比較，HepG2細(xì)胞內(nèi)E-鈣粘蛋白表達(dá)增加， Vimentin與α-SMA表達(dá)減少。
　　3.(1)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HepG2細(xì)胞表面整合素β1蛋白的表達(dá)：與空白對(duì)照組比較，加入守宮硫酸糖肽的三個(gè)劑量組整合素β1的表達(dá)均明顯減少（P<0.0

6、5）。
　　(2)通過(guò)Western-blot實(shí)驗(yàn)觀察HepG2細(xì)胞內(nèi)p-ERK與E-鈣粘蛋白的表達(dá)情況：守宮硫酸糖肽三個(gè)不同劑量組p-ERK蛋白的表達(dá)量均明顯低于空白對(duì)照組，而E-鈣粘蛋白的表達(dá)量則高于對(duì)照組。
　　(3)RT-PCR檢測(cè)HepG2細(xì)胞內(nèi)整合素信號(hào)通路上蛋白的表達(dá)：加藥組HepG2細(xì)胞內(nèi)整合素通路上的 Rho，Rac，cdc42，Arp3蛋白表達(dá)量均較空白對(duì)照組均明顯減少（P<0.05）。
　　結(jié)論：