N-ras與epiregulin聯(lián)合干擾對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制效果研究.pdf

1、肝癌發(fā)生和發(fā)展具有復(fù)雜的分子機(jī)制，有許多癌基因和信號(hào)傳導(dǎo)通路參與其中，多靶點(diǎn)聯(lián)合治療可能為肝癌的治療提供一種新的途徑。RNA干擾可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)靶點(diǎn)同時(shí)的特異性抑制，而且沒(méi)有傳統(tǒng)化學(xué)療法帶來(lái)的毒副作用，是一種有潛力的治療手段?；诒狙芯渴以贜—ras干擾治療肝癌研究的基礎(chǔ)上，尋找到一個(gè)參與N—ras干擾后的補(bǔ)償途徑調(diào)控基因epiregulin。該基因與N—ras基因聯(lián)合發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，對(duì)epiregulin與N—ras進(jìn)行雙干擾，可以達(dá)到更好

2、的治療效果。 一、瞬時(shí)及穩(wěn)定干擾N—ras基因?qū)Ω伟┘?xì)胞HepG2基因表達(dá)譜的影響。 1.RT-PCR法和Western blot法檢測(cè)瞬時(shí)及穩(wěn)定干擾后N—RasRNA及蛋白水平的變化。結(jié)果顯示瞬時(shí)和穩(wěn)定干擾后，HepG2細(xì)胞中N—Ras的RNA以及蛋白水平相對(duì)于未處理以及mock處理組而言都有明顯的降低。灰度掃描結(jié)果顯示抑制率均約為60％。 2.芯片實(shí)驗(yàn)檢測(cè)瞬時(shí)及穩(wěn)定干擾N—ras后變化的基因。與mock—si

3、RNA處理組相比，N—ras—siRNA處理24小時(shí)后上調(diào)的基因?yàn)?85個(gè)(ratio>1.5)，下調(diào)的基因?yàn)?06個(gè)(ratio<0.67)；N—Ras—siRNA干擾48小時(shí)后上調(diào)的基因?yàn)?91個(gè)，下調(diào)的基因?yàn)?48個(gè)：與HepG2/mock細(xì)胞相比，N—Ras穩(wěn)定干擾HepG2/N—ras(—)細(xì)胞上調(diào)的基因?yàn)?82個(gè)，下調(diào)的基因的基因?yàn)?24個(gè)。相對(duì)于瞬時(shí)干擾，穩(wěn)定干擾后基因表達(dá)變化的幅度大。 3.用DAVID生物信息學(xué)

4、資源數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因功能富集分析。穩(wěn)定干擾N—ras后的功能富集分析中出現(xiàn)了cell motility，actin filament—based process，acin cytoskeleton organization and biogenesis等關(guān)鍵詞。瞬時(shí)干擾N—ras48小時(shí)后的功能富集分析中出現(xiàn)了regulation of epithelial cell proliferation，regulation of cell pr

5、oliferation，cell adhesion等關(guān)鍵詞。瞬時(shí)干擾N—ras24小時(shí)后的功能富集分析中出現(xiàn)了cell cycle，regulation of progression through cell cycle，regulation of cell cycle等關(guān)鍵詞。說(shuō)明N—ras干擾后細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞骨架等方面相關(guān)的基因發(fā)生了變化。 4.用Pathwayminer進(jìn)行變化基因的通路分析。穩(wěn)定干擾N

6、—ras以及順時(shí)干擾N—ras48小時(shí)后，發(fā)生變化的通路相同，為focal adhesion，MAPK signaling pathway，regulation of actin cytoskeleton以及regulation of actin cytoskeleton，而瞬時(shí)干擾后24小時(shí)后變化的通路略有不同，依次為focal adhesion，cell cycle，MAPK signaling pathway以及wnt signa

7、ling pathway。 5.Gene Cluster 3.0以及Java TreeView對(duì)六張芯片結(jié)果進(jìn)行了聚類(lèi)分析。與穩(wěn)定干擾N—ras后的基因表達(dá)譜相比，瞬時(shí)干擾后的兩組芯片的基因表達(dá)譜更為接近。變化趨勢(shì)較為明顯的ClusterⅠ—Ⅳ主要參與的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程依次為angiogensis和growth，Catalytic activity，Inflammatory response和cell adhesion以及Secr

8、etory pathway。 6.用RT-PCR法驗(yàn)證三組芯片結(jié)果。穩(wěn)定干擾N—ras變化的基因中驗(yàn)證的有HDGFRP3，GPNMB，VRK1，MKI67，TM4SF3，EREG以及ACTG2。N—ras干擾48小時(shí)組中挑選的基因?yàn)锳CTC和FN1，N—ras瞬時(shí)干擾24小時(shí)組中挑選的基因?yàn)镋REG，芯片結(jié)果和RT-PCR結(jié)果較為符合。 7.觀察N—ras干擾對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響。N—ras—siRNA干擾HepG

9、2細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)變得狹長(zhǎng)，而mock—siRNA處理組的細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有明顯的變化。 二、篩選與N—ras聯(lián)合干擾具有協(xié)同效果的基因。 1.RT-PCR法驗(yàn)證ACTG2—siRNAs的干擾效果后，用SRB法檢測(cè)N—ras—siRNA與ACTG2—siRNA聯(lián)合干擾對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，濃度為100nM的ACTG2—siRNA1或N—ras—siRNA干擾后細(xì)胞的存活率分別為43.5％和66.5％。將濃度減半

10、(各50nM)，聯(lián)合干擾后細(xì)胞的存活率為67.5％，比抑制單基因略高，提高濃度(各100nM)后，聯(lián)合干擾后細(xì)胞的存活率降為28％。ACTG2—siRNA2的情況與ACTG2—siRNA1大體相同。 2.RT-PCR法驗(yàn)證EREG—siRNA的干擾效果后，用SRB法檢測(cè)N—ras—siRNA與EREG—siRNA聯(lián)合干擾對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，濃度為100nM的EREG—siRNA1或N—ras—siRNA干擾后的

11、細(xì)胞存活率分別為49％和41％。將濃度減半(各50nM)，聯(lián)合干擾后細(xì)胞的存活率為36％，比抑制單基因有明顯降低，提高濃度(各100nM)后，聯(lián)合干擾后細(xì)胞的存活率降為15％。EREG—siRNA2的情況與EREG—siRNA1大體相同。進(jìn)一步用SRB法檢測(cè)epiregulin受體EGFR的小分子抑制劑AG1478對(duì)N—ras干擾的細(xì)胞增殖抑制增效作用。結(jié)果表明與對(duì)照組和mock—siRNA干擾組相比，N—ras干擾組對(duì)AG1478更加

12、敏感。 3.RT-PCR法驗(yàn)證R—ras—siRNAs的干擾效果后，用SRB法檢測(cè)N—ras—siRNA與R—ras—siRNAs聯(lián)合干擾對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，濃度為100nM的R—ras—siRNA1或N—ras—siRNA干擾后細(xì)胞的存活率分別為43.5％和48％。將濃度減半(各50nM)，聯(lián)合干擾后細(xì)胞的存活率為39.5％，比抑制單基因有明顯降低，提高濃度(各100nM)后，細(xì)胞的存活率降為16％。

13、 4.RT-PCR法驗(yàn)證TM4SF1—siRNA的干擾效果后，用SRB法檢測(cè)N—ras—siRNA與TM4SF1—siRNA聯(lián)合干擾對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，干擾N—ras或TM4SF1后細(xì)胞的存活率分別為43.5％和65％。將濃度減半(各50nM)，細(xì)胞的存活率為66.5％，提高濃度(各100nM)后，細(xì)胞的存活率降為28.5％。 三、N—ras與epiregulin聯(lián)合干擾效果以及機(jī)理探討。 1.克隆形成

14、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)N—ras與epiregulin聯(lián)合干擾效果。結(jié)果表明N—ras—siRNA+EREG—siRNA1(各50nM)組與N—Ras—siRNA(100nM)以及EREG—siRNA1(100nM)組相比克隆形成數(shù)少量降低。N—Ras—siRNA+EREG—siRNA1(各100nM)與N—Ras—siRNA(100nM)以及EREG—siRNA1(100nM)組相比克隆形成數(shù)顯著降低。此結(jié)果與N—ras與epiregulin聯(lián)合干

15、擾的SRB實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)N—ras以及epiregulin干擾對(duì)細(xì)胞周期分布的影響。結(jié)果表明，干擾N—ras與epiregulin均可增加G0/G1期細(xì)胞，降低S期細(xì)胞。與對(duì)照細(xì)胞相比，干擾N—ras或epiregulin使G0/G1期細(xì)胞分別增加了14.7％和11.9％。聯(lián)合干擾N—ras和epiregulin使G0/G1期細(xì)胞增加到20.4％。結(jié)果證明單干擾N—ras或epiregulin均可造成一定的G

16、0/G1期阻滯，而聯(lián)合干擾會(huì)增強(qiáng)這種效應(yīng)。 3.Western blot檢測(cè)N—ras以及epiregulin聯(lián)合干擾對(duì)MAPK以及PI3K—Akt通路蛋白的影響。實(shí)驗(yàn)表明，干擾N—ras或epiregulin均可使ERK1/2和Akt的磷酸化水平降低，而總ERK1/2及Akt蛋白水平保持不變。干擾N—ras或epiregulin也可使c—myc蛋白表達(dá)降低。聯(lián)合干擾N—ras和epiregulin會(huì)增強(qiáng)上述效應(yīng)。 4.

17、Western blot檢測(cè)N—ras以及epiregulin聯(lián)合干擾對(duì)G1期蛋白的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干擾N—ras或epiregulin均可降低Rb的磷酸化水平以及cyclinD1蛋白的表達(dá)水平，升高p21的表達(dá)水平。聯(lián)合干擾N—ras和epiregulin會(huì)增強(qiáng)上述效應(yīng)。這個(gè)結(jié)果支持了第2部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并進(jìn)一步證明聯(lián)合干擾N—ras和epiregulin可以通過(guò)對(duì)G0/G1期的阻滯來(lái)發(fā)揮作用。 綜上所述，基因芯片結(jié)果表明