靶向shRNA沉默Glypican-3基因?qū)ΣG丸卵黃囊瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的初步研究.pdf

1、[目的]選用經(jīng)原代培養(yǎng)建立的睪丸卵黃囊瘤(testicularyolk sac tumor，TYST)細(xì)胞，鑒定其生物學(xué)特性;利用慢病毒介導(dǎo)shRNA去干擾此細(xì)胞的Glypican-3基因，評(píng)估慢病毒載體的感染效率及沉默后細(xì)胞凋亡率的變化。
　　[方法]
　　1.以含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞。利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài);制作細(xì)胞電鏡標(biāo)本，利用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。
　

2、　2.制作睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞爬片，利用免疫熒光法檢測細(xì)胞中GPC3、AFP以及Ki-67的表達(dá)。
　　3.使用MTT法繪制細(xì)胞生長曲線并計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間。
　　4.流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期及DNA進(jìn)行分析
　　5.將雄性BALB/c(nu/nu)裸鼠隨機(jī)分為2組(n=3)，分別設(shè)為腫瘤細(xì)胞接種組及生理鹽水對(duì)照組。用5×106/ml的腫瘤細(xì)胞接種到裸鼠雙側(cè)腹股溝皮下，每側(cè)200ul，對(duì)照組每側(cè)腹股溝皮下注射200ul生理鹽水。

3、每周觀察裸鼠生長狀態(tài)及腫瘤生長情況。
　　6.由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成shRNA-GPC3干擾序列，并用慢病毒GV248包裝。
　　7.感染前預(yù)實(shí)驗(yàn):摸索睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞的MOI(multiplicity ofinfection，MOI)值，以及嘌呤霉素最優(yōu)篩選濃度。
　　8.止式感染實(shí)驗(yàn)，分shRNA-GPC3干擾組、shRNA-N陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組三個(gè)組，按照預(yù)實(shí)驗(yàn)中測得的MOI值進(jìn)行感染，并用最

4、優(yōu)濃度嘌呤霉素進(jìn)行篩選。
　　9.利用Western Blot以及實(shí)時(shí)PCR法，檢測shRNA干擾前后細(xì)胞中GPC3在mRNA及蛋白水平的表達(dá)變化。
　　10.流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測shRNA干擾后，睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞的凋亡率。
　　[結(jié)果]
　　1.睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué):倒置顯微鏡下觀察，可見培養(yǎng)的細(xì)胞呈貼壁生長，形態(tài)不規(guī)則，為多角形或梭形。聚集時(shí)細(xì)胞可排列成束狀，接觸抑制現(xiàn)象消失，生長密集時(shí)，細(xì)胞可呈多層重疊生長

5、;透射電子顯微鏡下可見細(xì)胞形狀不規(guī)則并有較多絨毛突起，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體數(shù)量減少，吞飲小泡及殘質(zhì)體數(shù)量增多，并見不同形成階段的髓樣小體。核高度異形，核膜曲折，異染色質(zhì)緊貼核膜，常染色質(zhì)豐富，每個(gè)核可見1～3個(gè)核仁。
　　2.免疫熒光法檢測細(xì)胞中GPC3、AFP以及Ki-67的表達(dá)。AFP和GPC3在本次研究的細(xì)胞中均由較高的表達(dá)，而Ki-67的表達(dá)較弱。
　　3.由細(xì)胞生長曲線可計(jì)算出細(xì)胞倍增時(shí)間為33.5h。
　　4.流

6、式細(xì)胞學(xué)分析顯示，細(xì)胞為4倍體，以G2、M期細(xì)胞增多為主，符合腫瘤細(xì)胞的特性。
　　5.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中，腫瘤細(xì)胞接種組有2只長出瘤塊，成瘤率為66.7％;對(duì)照組3只裸鼠都沒有腫瘤長出。
　　6.感染預(yù)實(shí)驗(yàn)提示，當(dāng)病毒的滴度為5×107TU/ml時(shí)，80％以上的睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞都有綠色熒光表達(dá)，因此它的MOI值為50;在嘌呤霉素抗性壓力篩選下，8天后，濃度≥6mg/ml的孔中YST細(xì)胞全部死亡，即最優(yōu)篩選濃度為≥6mg/ml。

7、
　　7.Western Blot檢測shRNA干擾后，細(xì)胞GPC3蛋白表達(dá)的變化。
　　Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)病毒感染細(xì)胞72h后，shRNA-GPC3干擾組細(xì)胞內(nèi)GPC3蛋白的表達(dá)水平為0.63±0.13，與shRNA-N陰性干擾組1.35±0.17及空白對(duì)照組1.59±0.42相比有著明顯的降低，并且差異有顯著意義，P＜0.05。
　　8.實(shí)時(shí)PCR檢測干擾后細(xì)胞內(nèi)GPC3在mRNA水平上的表達(dá)變化。結(jié)

8、果證實(shí)在感染48h后，與對(duì)照組相比，shRNA干擾組mRNA抑制率達(dá)到75％以上，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)，這與Western Blot的結(jié)果一致。
　　9.流式細(xì)胞學(xué)檢測細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，shRNA-GPC3干擾組感染睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞48h后，細(xì)胞的凋亡率為22.16％±1.10％，shRNA-N陰性對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為8.33％±0.96％，空白對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為3.95±0.90％。干擾組與兩組對(duì)照組相比，P＜0.0

9、5，差異有顯著意義，陰性對(duì)照組與空白組相比，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　[結(jié)論]
　　1.本次實(shí)驗(yàn)證實(shí)了經(jīng)腫瘤組織原代培養(yǎng)的細(xì)胞為小兒睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞，體外培養(yǎng)時(shí)，其生物學(xué)性狀穩(wěn)定，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供了細(xì)胞基礎(chǔ)。
　　2.慢病毒載體G248可以有效的感染體外培養(yǎng)的睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞。
　　3.shRNA-GPC3作用于睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞后，能明顯降低GPC3在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。
　　4.G