SALL4+RNAi技術(shù)對睪丸卵黃囊瘤的生物學(xué)功能研究.pdf

1、目的:利用RNAi技術(shù)，通過質(zhì)粒表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo-SALL4 shRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的兒童睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞，對SALL4基因干擾后檢測細(xì)胞的增殖、凋亡及周期變化。從細(xì)胞分子水平初步了解SALL4基因?qū)ΣG丸卵黃囊瘤發(fā)生發(fā)展的影響，為睪丸卵黃囊瘤的生物治療提供新的治療靶點。
　　方法:1.設(shè)計四條針對不同靶點的SALL4特異性siRNA和一條陰性干擾siRNA分子克隆的方法構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-SALL4 sh

2、RNA。
　　2.分別用不同比例(DNA: Lipofectamine2000)的復(fù)合物轉(zhuǎn)染睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞，初步比較轉(zhuǎn)染效率，選擇轉(zhuǎn)染效果最佳濃度。
　　3.分6個實驗組:空白對照組(Blank control)、SALL4-1157、SALL4-1837、SALL4-2484、 SALL4-2600、 SALL4-NC。
　　4.將構(gòu)建好的pGPU6/GFP/Neo-SALL4 shRNA分別轉(zhuǎn)染睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞。

3、
　　5.用實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測轉(zhuǎn)染睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞48小時后SALL4 mRNA的表達(dá)量。
　　6.Western blot檢測轉(zhuǎn)染睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞72小時后SALL4蛋白表達(dá)量。
　　7.比較各組SALL4的表達(dá)情況，篩選出干擾效率最佳的序列。
　　8.SALL4 RNA干擾對睪丸卵黃囊瘤的增殖及凋亡影響研究。
　　1) CCK-

4、8法檢測睪丸卵黃囊瘤的增殖水平:實驗組分為空白對照組、陰性干擾組、SALL4干擾組，每組設(shè)置三個復(fù)孔分別轉(zhuǎn)染后取12、24、48、72小時后加CCK-8試劑，測定OD值，取平均值。
　　2)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡與周期:實驗分三個實驗組（空白對照組、陰性干擾組、SALL4干擾組），轉(zhuǎn)然24小時后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和周期。
　　結(jié)果:1.成功構(gòu)建分別針對SALL4mRNA的不同位點:mRNA1157、mRNA1837、m

5、RNA2484、mRNA2600的pGPU6/GFP/Neo-SALL4 shRNA。
　　2.在2×、1×、0.5×的DNA-脂質(zhì)體濃度下，質(zhì)粒干擾載體均能通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞。其中2×DNA-脂質(zhì)體濃度，轉(zhuǎn)染效率最佳。
　　3.分別轉(zhuǎn)染干擾序列shRNA48小時后，相對于空白對照而言，四個SALL4干擾組基因的mRNA水平降低均有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05），特別是 SALL4-1837，相比其他三組干擾序列

6、，mRNA的表達(dá)最低。
　　4.分別轉(zhuǎn)染干擾序列ShRNA72小時后，相對于空白對照組而言，四個SALL4干擾組蛋白表達(dá)水平降低均有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，主要是1837位點，與PCR結(jié)果一致。
　　5.轉(zhuǎn)染SALL4 shRNA，干擾睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞SALL4表達(dá)后，相比空白組和陰性干擾組，細(xì)胞增殖能力降低有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。空白對照組與陰性干擾組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　6.轉(zhuǎn)染SALL4 shRNA

7、，干擾睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞SALL4表達(dá)后，流式結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染SALL4-1837相對其他兩組， G0期細(xì)胞比例明顯增加，M期細(xì)胞比例則明顯低于其他兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）。SALL4-1837組細(xì)胞凋亡率明顯高于其他的兩組，。而空白對照組與陰性干擾組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:1.本實驗構(gòu)建的pGPU6/GFP/Neo-SALL4 shRNA均能通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞。
　　2.從干擾效果來看，四

8、組干擾載體均能有效干擾SALL4mRNA和蛋白的表達(dá)。其中相比其他三組，mRNA1837干擾位點的mRNA和蛋白表達(dá)最低，干擾效果最佳，可選取該干擾載體，完成下一步SALL4基因生物學(xué)功能研究。
　　3.轉(zhuǎn)染SALL4-1837質(zhì)粒，干擾睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞SALL4表達(dá)后，細(xì)胞增殖能力明顯降低，表明SALL4對維持睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞的生長具有一定作用。
　　4.轉(zhuǎn)染SALL4-1837質(zhì)粒，干擾睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞SALL4表達(dá)后，