靶向Notch1 shRNA重組質(zhì)粒的構建及其對L02-HBx細胞生物學行為的影響.pdf

1、目的:
　　 前期研究初步發(fā)現(xiàn)HBx可激活L02細胞的Notch1信號通路并參與肝細胞的惡性轉(zhuǎn)化，本研究擬通過構建靶向Notch1基因的shRNA重組質(zhì)粒干擾阻斷L02/HBx細胞Notch1信號通路后觀察其對細胞增殖、周期及凋亡的影響，旨在探討Notch1信號通路在HBx致L02細胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用及分子機制。
　　 方法:
　　 （1）設計3對針對Notch1基因不同位點的shRNA片段的真核表達載體，脂質(zhì)體

2、介導轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)基因細胞L02/HBx，qRT-PCR及Western Blotting分別檢測瞬時轉(zhuǎn)染pshRNA 前后Notch1蛋白及mRNA的表達，篩選出干擾效率最強的pshRNA；
　　 （2）將篩選出的干擾效率最強的pshRNA 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至L02/HBx細胞，qRT-PCR及Western Blotting 檢測Notch1 信號通路各組分mRNA 及蛋白的表達；
　　 （3） CCK-8 法和流式細胞學分別檢測干

3、擾阻斷Notch1 信號通路前后L02/HBx細胞增殖及周期凋亡的變化；
　　 （4） qRT-PCR及Western Blotting 檢測干擾阻斷Notch1 信號通路前后L02/HBx細胞周期抑制因子P16 及細胞凋亡抑制因子Bcl-2表達的變化；
　　 （5）電泳遷移率變動分析（EMSA）法檢測干擾阻斷Notch1 信號通路前后L02/HBx細胞NF-κB的DNA結合率的變化。
　　 結果:
　　

4、 （1）成功構建含Notch1 shRNA片段的重組質(zhì)粒，分別命名為pshRNA1、2、3，瞬時轉(zhuǎn)染L02/HBx細胞后，Notch1基因的mRNA 及蛋白表達水平均下調(diào)。其中，pshRNA1 重組質(zhì)粒的沉默效應最強，其RNA水平的抑制率為78.83％（p<0.05）。
　　 （2）將干擾效率最強的pshRNA1 重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至L02/HBx細胞后，qRT-PCR及Western Blotting 檢測Notch1 信號通路

5、Notch1 受體、Jagged1 配體及靶基因Hes1的mRNA 及蛋白表達均下調(diào)（p<0.01），其中Notch1基因RNA水平的抑制率達91.68％（p<0.01）。
　　 （3）運用pshRNA1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染L02/HBx細胞干擾阻斷Notch1 信號通路后，CCK-8及流式細胞學檢測L02/HBx-shRNA1細胞增殖、周期與凋亡狀況，與對照組相比，其細胞增殖速度減慢(p<0.05)，細胞周期的G0/G1 期細胞比例增加

6、（p<0.01）、S 期細胞比例減少（p<0.05），細胞凋亡增加（p<0.05）。
　　 （4）運用pshRNA1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染L02/HBx細胞干擾阻斷Notch1 信號通路后，qRT-PCR及Western Blotting 檢測L02/HBx-shRNA1細胞的細胞周期抑制因子P16 及凋亡抑制因子Bcl-2的表達水平。與對照組相比，P16的mRNA 及蛋白表達均上調(diào)(p<0.05)，Bcl-2的mRNA 及蛋白表達均下調(diào)(

7、p<0.001)。
　　 （5）運用pshRNA1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染L02/HBx細胞干擾阻斷Notch1 信號通路后，EMSA 檢測發(fā)現(xiàn)L02/HBx-shRNA1細胞的NF-κB的DNA結合率降低。
　　 結論:
　　 （1）靶向Notch1基因的shRNA的重組質(zhì)粒構建成功，含靶向Notch1基因的shRNA的重組質(zhì)粒能有效阻斷Notch1信號通路；
　　 （2）干擾Notch1信號通路可以抑制L02/HB

8、x細胞的增殖，阻礙其細胞周期進程及促進凋亡，結合前期的研究結果，HBx 可激活Notch1 信號通路并促進L02細胞的增殖與轉(zhuǎn)化，表明HBx可能通過Notch1信號通路的激活來促進L02細胞的惡性轉(zhuǎn)化；
　　 （3）在干擾Notch1信號通路抑制L02/HBx細胞的增殖，阻礙其細胞周期進程及促進凋亡的過程中，可能通過上調(diào)細胞周期抑制因子P16與下調(diào)細胞凋亡抑制因子Bcl-2的表達而起作用；
　　 （4） Notch1 信