激活突變SHP-2酪氨酸磷酸酶促進(jìn)砷導(dǎo)致的MEFs惡性轉(zhuǎn)化和裸鼠成瘤風(fēng)險(xiǎn).pdf

1、【背景及目的】
　　惡性腫瘤是威脅人類健康的重要疾病之一,近年來(lái)呈現(xiàn)發(fā)病率升高及發(fā)病早齡化的趨勢(shì)。多項(xiàng)研究提示,腫瘤的發(fā)生(tumorigenicity)受到環(huán)境因素(environmentalfators)和遺傳因素(geneticfactors)共同調(diào)控,并且是一個(gè)多因素,復(fù)雜的長(zhǎng)期過(guò)程。因此對(duì)其內(nèi)外因素在腫瘤發(fā)生過(guò)程中作用機(jī)制的研究顯得尤為重要。
　　SHP-2(Srchomology2-containingprote

2、intyrosinephosphatase,SHP-2)是一種廣泛存在與哺乳動(dòng)物多種組織細(xì)胞中的非受體型酪氨酸磷酸酶,參與細(xì)胞的存活、遷移、粘附、細(xì)胞骨架形成等生理過(guò)程。研究表明,其突變體在努南綜合征(Noonansyndrome,伴髓系異常增殖病),髓系增殖病,幼年型粒單細(xì)胞白血病(Juvenilemyelomonocyticleukemia,JMML)及其他白血病和一些實(shí)體瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本課題組一直致力于研究SHP-2

3、蛋白(由PTPN11編碼)在白血病及實(shí)體瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。并且我們發(fā)現(xiàn)SHP-2激活突變(gain-of-functionmutation,GOFmutation)可能參與環(huán)境因素導(dǎo)致的小鼠白血病、實(shí)體瘤等惡性疾病的發(fā)生。D61G/D61Y的激活是SHP-2最常見(jiàn)的激活突變體,Neel實(shí)驗(yàn)室通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)發(fā)現(xiàn)D61G突變使SHP-2活性發(fā)生一定程度增強(qiáng),并且他們建立了此SHP-2D61G/+基因敲入小鼠模型,發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)努南綜合征

4、的表征、并伴隨髓系異常增殖,出現(xiàn)脾臟腫大等癥狀,但是卻沒(méi)有白血病等惡性疾病的發(fā)生。
　　我們?cè)O(shè)想可能因?yàn)榇诵∈箫曫B(yǎng)在SPF(Specificpathogenfree)級(jí)環(huán)境中,沒(méi)有接觸任何外界環(huán)境污染物,所以才沒(méi)有發(fā)生白血病等惡性疾病。于是我們使用MNU(methylnitrosourea)處理此模型小鼠,流式檢測(cè)結(jié)果顯示小鼠白血病發(fā)病率明顯升高。但是在日常生活中人們不可能接觸到如此高劑量、高純度的DNA損傷劑。查閱相關(guān)文獻(xiàn)及流行

5、病學(xué)資料,我們選用一種類金屬污染物As2O3(Arsenictrioxide),來(lái)處理MEFs(SHP-2+/+)和MEFs(SHP-2D61G/+)細(xì)胞,以觀察在As2O3導(dǎo)致MEFs細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及裸鼠體內(nèi)實(shí)體瘤形成的過(guò)程中,SHP-2激活突變扮演怎樣的角色。
　　砷是國(guó)際癌癥研究中心(InternationalAgencyforResearchonCancer,IARC)確認(rèn)的化學(xué)致癌物。有研究表明砷及其代謝產(chǎn)物,可以誘導(dǎo)產(chǎn)生

6、ROS(Reactiveoxygenspecies),引起氧化應(yīng)激,進(jìn)而通過(guò)導(dǎo)致DNA損傷、異常活化多種信號(hào)通路等機(jī)制,來(lái)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。為了進(jìn)一步探討在As2O3和SHP-2D61G/+導(dǎo)致MEFs細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中ROS是否參與,我們使用矢車菊-3-葡萄糖苷(Cyanidin-3-glucoside,C3G)作為ROS抑制劑與As2O3聯(lián)合處理MEFs細(xì)胞,觀察ROS抑制后細(xì)胞生物學(xué)行為及裸鼠體內(nèi)實(shí)體瘤形成情況的變化。
　　【

7、方法】
　　1.用0.5μMAs2O3和20μMC3G處理已建立的SHP-2+/+和SHP-2D61G/+MEFs細(xì)胞,構(gòu)建穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型。
　　2.用MTT和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)情況,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞增殖周期的變化,用軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞非錨定生長(zhǎng)能力,用粘附試驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞粘附和遷移能力;用裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力。
　　3.用5μMAs2O

8、3和20μMC3G處理MEFs細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞ROS水平的變化。
　　4.用5μMAs2O3急性處理SHP-2+/+和SHP-2D61G/+MEFs細(xì)胞,Westernblotting檢測(cè)Erk、P38、JNK、Akt的活化情況。
　　【結(jié)果】
　　1.成功構(gòu)建了As2O3和C3G處理的MEFs轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型。
　　2.MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果提示,低劑量As2O3處理促進(jìn)了細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖能力,并且SH

9、P-2激活突變對(duì)此效應(yīng)起正調(diào)控作用。
　　3.細(xì)胞周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn),低劑量As2O3處理導(dǎo)致處于S期的細(xì)胞比例增高;而SHP-2激活突變加劇此效應(yīng)。
　　4.低劑量As2O3處理促進(jìn)了MEFs細(xì)胞非錨定生長(zhǎng)能力,而SHP-2激活突變?cè)诖诉^(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,As2O3處理組集落形成個(gè)數(shù)明顯增加并且體積更大;尤其是SHP-2激活后此效應(yīng)更為顯著。
　　5.粘附和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,低

10、劑量As2O3處理導(dǎo)致細(xì)胞粘附和遷移能力增強(qiáng),并且SHP-2激活突變加劇此效應(yīng)。
　　6.SHP-2激活突變?cè)诘蛣┝緼s2O3導(dǎo)致MEFs細(xì)胞裸鼠體內(nèi)成瘤過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用。
　　7.相關(guān)機(jī)制初步探討發(fā)現(xiàn),As2O3和SHP-2D61G/+導(dǎo)致MEFs惡性轉(zhuǎn)化,可能與MAPK/ERK,MAPK/JNK,MAPK/P38,PI3K/ATK的活化有關(guān)。
　　8.As2O3急性處理即可刺激MEFs細(xì)胞產(chǎn)生ROS,SHP-2激

11、活突變可以促進(jìn)ROS的產(chǎn)生;而C3G可以顯著降低ROS水平。
　　9.C3G處理可以顯著抑制As2O3導(dǎo)致的MEFs惡性轉(zhuǎn)化及裸鼠成瘤的風(fēng)險(xiǎn)。同樣運(yùn)用上述細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),C3G抑制ROS后,As2O3處理促進(jìn)MEFs細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、粘附、遷移、克隆形成及非錨定生長(zhǎng)能力的情況均得到一定程度的抑制。并且裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)也得到類似結(jié)果。
　　【結(jié)論】
　　1.低劑量As2O3可以促進(jìn)MEFs細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及裸鼠成瘤,在此