蟲生菌提取物中酪氨酸酶抑制劑的篩選及分離鑒定.pdf

1、本研究以酪氨酸酶的抑制活性為篩選指標(biāo)，對(duì)50株蟲生真菌的提取物進(jìn)行了篩選，篩選出能夠產(chǎn)生酪氨酸酶抑制劑的高活性菌株，并對(duì)高活性菌株提取物中活性組分進(jìn)行了分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定研究。
　　對(duì)50株蟲生真菌固體培養(yǎng)菌絲體甲醇提取物的篩選結(jié)果表明，供試蟲生真菌各菌株提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用存在較大差異，其中古尼擬青霉各菌株均表現(xiàn)出相對(duì)較高的抑制活性。通過對(duì)7株古尼擬青霉菌株的固體培養(yǎng)菌絲體和液體培養(yǎng)發(fā)酵液甲醇提取物對(duì)酪氨酸酶抑制活性及

2、對(duì)DPPH自由基的清除活性的比較分析，發(fā)現(xiàn)菌株RCEF0199的固體菌絲體提取物同時(shí)具有最強(qiáng)的酪氨酸酶抑制活性和對(duì)DPPH自由基的清除活性，因此，以該菌株作為高活性目標(biāo)菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究。
　　實(shí)驗(yàn)通過比較菌株RCEF0199的菌絲體的不同溶劑提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制活性及清除自由基活性，發(fā)現(xiàn)菌絲體的甲醇提取物活性最高。該提取物對(duì)酪氨酸酶二酚酶的半抑制濃度(IC50)為0.048mg/mL。
　　抑制機(jī)制研究表明提取物對(duì)酪氨酸

3、酶二酚酶的抑制機(jī)理屬于可逆抑制，抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)性抑制，米氏常數(shù)(Km)隨提取物濃度的增大而增大，表明酶對(duì)底物的親和力隨著提取物濃度的增大而降低，提取物阻礙了酶與底物的結(jié)合，使得酶的催化活性降低。反應(yīng)體系中不加入提取物時(shí)求得的米氏常數(shù)(Km)為1.02mmol/L，根據(jù)直線斜率和Km值求得最大反應(yīng)速度（Vmax）為186.44U/min，求得提取物對(duì)游離酶的抑制常數(shù)(KI)為555.56μg/mL。
　　以跟蹤反應(yīng)進(jìn)程的方式測(cè)定樣品

4、對(duì)單酚酶反應(yīng)遲滯時(shí)間和催化效率的影響，結(jié)果表明甲醇提取物對(duì)單酚酶活力的影響表現(xiàn)為延長(zhǎng)反應(yīng)遲滯時(shí)間，影響機(jī)制表現(xiàn)為提取物的自由基清除作用阻礙了反應(yīng)的引發(fā)。菌絲甲醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除活性的測(cè)定結(jié)果表明，隨著提取物濃度的增加其自由基清除活性逐漸增強(qiáng)，當(dāng)提取物濃度為1.0 mg/ml時(shí)其清除率達(dá)到94.66％。
　　實(shí)驗(yàn)采用半制備型色譜柱對(duì)提取物組分進(jìn)行初步分離，以抑制酪氨酸酶活性和清除自由基活性為測(cè)定指標(biāo)對(duì)分離組分進(jìn)行了活性測(cè)

5、定，確定出三種活性組分p-1、p-2、p-3，這三種組分均同時(shí)具有抑制酪氨酸酶活性和清除自由基活性。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用高速逆流色譜經(jīng)兩次分離成功制備出三種活性組分，第一次分離的溶劑體系為:正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸∶水=3.5∶5∶3.5∶0.15∶5(V/V/V//V/V);第二次分離選擇的溶劑體系為:正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸∶水=2.5∶5∶2.5∶0.15∶5(V/V/V//V/V)。三種活性組分p-1、p-2、p-3純度分別為

6、91.7％、94.5％、96.8％，且組分p-1呈現(xiàn)為黃綠色粉末;組分p-2和p-3均呈現(xiàn)為黃色粉末。
　　經(jīng)LC-TOF-MS和NMR數(shù)據(jù)解析得知，化合物p-3的分子式為C15H12O6，系統(tǒng)學(xué)名為:6，7，8，9-四羥基-3-甲氧基-4-甲基-1-芴酮;化合物p-1的分子式為C15H13NO5，系統(tǒng)學(xué)名為:6，7，8-三羥基-9-氨基-3-甲氧基-4-甲基-1-芴酮，為p-3的結(jié)構(gòu)類似物，其9位羥基被氨基取代;化合物p-2的分