酪氨酸激酶抑制劑篩選方法的建立及姜黃素衍生物的篩選.pdf

1、目的：進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)條件的摸索，建立蛋白酪氨酸激酶(PTK)抑制劑的快速篩選方法，并應(yīng)用此方法對(duì)姜黃素衍生物進(jìn)行體外篩選，得到有抑制蛋白酪氨酸激酶活性的衍生物。初步探索姜黃素衍生物對(duì)Ph+的K562細(xì)胞P210Bcr/Abl融合蛋白PTK活性的影響及其機(jī)制。
　　 方法：采用MTT法檢測(cè)姜黃素衍生物對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響。用建立的聚谷氨酸鈉∶酪氨酸(4∶1)為激酶反應(yīng)底物、以磷酸化酪氨酸特異性單克隆抗體檢測(cè)磷酸化酪氨酸殘基的酶聯(lián)

2、免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)方法，以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)做為辣根過(guò)氧化物酶底物顯色，篩選姜黃素衍生物對(duì)蛋白酪氨酸激酶活性的抑制作用。用Western blotting方法觀察Cur衍生物對(duì)p210Bcr-Abl蛋白含量和蛋白酪氨酸磷酸化以及下游信號(hào)分子的影響。
　　 結(jié)果：測(cè)定了Cur及其衍生物對(duì)體外培養(yǎng)K562細(xì)胞增殖的抑制作用，Cur衍生物的IC50均比Cur

3、低。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步用我們建立的ELISA法篩選上述Cur衍生物中對(duì)K562細(xì)胞PTK活性有抑制作用的藥物，得到4種蛋白酪氨酸激酶抑制劑，分別為姜黃素衍生物FM0815、FM0817、FM0822及FM0824。其中姜黃素衍生物FM0824可下調(diào)p210Bcr-Abl和蛋白酪氨酸磷酸化以及下游信號(hào)分子的表達(dá)。
　　 結(jié)論：建立的方法具有快速、簡(jiǎn)便可行、高通量的特點(diǎn)，可用于蛋白酪氨酸激酶抑制劑的體外篩選。Cur及其衍生物對(duì)PTK有