絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶Stk在表皮葡萄球菌生物膜形成中的作用及其機制研究.pdf

1、目的：闡明絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Serine/Threonine Protein Kinase，stk)在表皮葡萄球菌生物膜形成過程中的作用。
　　 方法：利用同源重組構(gòu)建stk突變菌株；將stk基因全長以及各功能域克隆到質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化入stk突變菌株獲得互補菌株；采用生物膜半定量方法檢測各菌株生物膜的形成；采用初始粘附實驗和免疫斑點雜交方法檢測不同表皮葡萄球菌菌株的粘附能力和多糖胞間粘附素(Polysaccharide Int

2、ercellular Adhesin，PIA)的合成；利用實時熒光定量PCR(Real-time PCR，RT-PCR)檢測生物膜相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平；采用Kinase-GloTM激酶發(fā)光檢測試劑盒檢測體外純化的蛋白激酶活性。
　　 結(jié)果：為了研究stk在表皮葡萄球菌生物膜形成中的作用，我們構(gòu)建了stk突變菌株并比較了突變菌株與野生菌株生物膜形成的差異，發(fā)現(xiàn)stk突變菌株生物膜形成能力顯著下降，同時構(gòu)建的stk基因全長互補菌株顯示

3、生物膜形成能力完全回復(fù)，證明stk基因?qū)Ρ砥て咸亚蚓锬さ男纬删哂兄匾饔谩?br>　　 Stk蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)它具有兩個功能域，即蛋白激酶功能域和PASTA(pencilin binding protein and serine/threonine kinase-associated)重復(fù)序列功能域，為研究是哪個功能域在生物膜形成中起作用，我們構(gòu)建了不同功能域的過表達質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)入stk突變菌株，檢測其生物膜表型，發(fā)現(xiàn)具有激酶功能

4、域的互補菌株其生物膜表型回復(fù)，而PASTA功能域?qū)ι锬ば纬蓻]有作用。為了進一步證明激酶活性對生物膜形成的重要性，我們構(gòu)建了stk激酶功能域不同區(qū)域的截短突變和點突變，一方面體外表達純化不同突變蛋白并檢測它們的激酶活性，另一方面檢測不同突變互補株的生物膜表型，結(jié)果表明激酶活性直接影響生物膜的形成，無激酶活性的互補株不能形成生物膜。
　　 與野生菌株相比，stk突變菌株對高分子材料的粘附能力顯著下降，并且細胞間粘附因子PIA的合成

5、量減少，這兩個表型變化可能是突變菌株生物膜形成能力下降的原因。為了研究stk影響生物膜形成的分子機制，我們利用RT-PCR檢測了目前已知的與生物膜形成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)stk突變菌株中，與PIA合成密切相關(guān)的ica操縱子以及粘附因子atlE的轉(zhuǎn)錄水平較野生菌株顯著降低，而agr數(shù)量閾值感應(yīng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，提示Stk可能通過其激酶活性磷酸化修飾相應(yīng)的底物蛋白，影響生物膜相關(guān)因子的表達。
　　 我們的研究同時顯示，st

6、k基因不僅調(diào)控細菌生物膜的形成，而且也影響其生理代謝，如影響腺嘌呤的合成和細胞壁的代謝。在營養(yǎng)缺陷的RPMI1640培養(yǎng)基中，stk突變菌株生長速率較野生菌株顯著降低，而在培養(yǎng)基中加入腺嘌呤可以使其生長缺陷得到回復(fù)。透射電鏡可以觀察到突變菌株的細胞壁結(jié)構(gòu)異常；進一步研究發(fā)現(xiàn)突變菌株對Triton X-100的敏感性顯著降低，分泌自溶素的能力也缺乏，同時突變菌株對作用于細胞壁的抗生素敏感性增強，提示Stk影響表皮葡萄球菌細胞壁的代謝。