絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶Stk在表皮葡萄球菌生物膜形成中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：闡明絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Serine/Threonine Protein Kinase，stk)在表皮葡萄球菌生物膜形成過程中的作用。
　　 方法：利用同源重組構(gòu)建stk突變菌株；將stk基因全長以及各功能域克隆到質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化入stk突變菌株獲得互補(bǔ)菌株；采用生物膜半定量方法檢測各菌株生物膜的形成；采用初始粘附實驗和免疫斑點(diǎn)雜交方法檢測不同表皮葡萄球菌菌株的粘附能力和多糖胞間粘附素(Polysaccharide Int

2、ercellular Adhesin，PIA)的合成；利用實時熒光定量PCR(Real-time PCR，RT-PCR)檢測生物膜相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平；采用Kinase-GloTM激酶發(fā)光檢測試劑盒檢測體外純化的蛋白激酶活性。
　　 結(jié)果：為了研究stk在表皮葡萄球菌生物膜形成中的作用，我們構(gòu)建了stk突變菌株并比較了突變菌株與野生菌株生物膜形成的差異，發(fā)現(xiàn)stk突變菌株生物膜形成能力顯著下降，同時構(gòu)建的stk基因全長互補(bǔ)菌株顯示

3、生物膜形成能力完全回復(fù)，證明stk基因?qū)Ρ砥て咸亚蚓锬さ男纬删哂兄匾饔谩?br>　　 Stk蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)它具有兩個功能域，即蛋白激酶功能域和PASTA(pencilin binding protein and serine/threonine kinase-associated)重復(fù)序列功能域，為研究是哪個功能域在生物膜形成中起作用，我們構(gòu)建了不同功能域的過表達(dá)質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)入stk突變菌株，檢測其生物膜表型，發(fā)現(xiàn)具有激酶功能

4、域的互補(bǔ)菌株其生物膜表型回復(fù)，而PASTA功能域?qū)ι锬ば纬蓻]有作用。為了進(jìn)一步證明激酶活性對生物膜形成的重要性，我們構(gòu)建了stk激酶功能域不同區(qū)域的截短突變和點(diǎn)突變，一方面體外表達(dá)純化不同突變蛋白并檢測它們的激酶活性，另一方面檢測不同突變互補(bǔ)株的生物膜表型，結(jié)果表明激酶活性直接影響生物膜的形成，無激酶活性的互補(bǔ)株不能形成生物膜。
　　 與野生菌株相比，stk突變菌株對高分子材料的粘附能力顯著下降，并且細(xì)胞間粘附因子PIA的合成

5、量減少，這兩個表型變化可能是突變菌株生物膜形成能力下降的原因。為了研究stk影響生物膜形成的分子機(jī)制，我們利用RT-PCR檢測了目前已知的與生物膜形成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)stk突變菌株中，與PIA合成密切相關(guān)的ica操縱子以及粘附因子atlE的轉(zhuǎn)錄水平較野生菌株顯著降低，而agr數(shù)量閾值感應(yīng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，提示Stk可能通過其激酶活性磷酸化修飾相應(yīng)的底物蛋白，影響生物膜相關(guān)因子的表達(dá)。
　　 我們的研究同時顯示，st

6、k基因不僅調(diào)控細(xì)菌生物膜的形成，而且也影響其生理代謝，如影響腺嘌呤的合成和細(xì)胞壁的代謝。在營養(yǎng)缺陷的RPMI1640培養(yǎng)基中，stk突變菌株生長速率較野生菌株顯著降低，而在培養(yǎng)基中加入腺嘌呤可以使其生長缺陷得到回復(fù)。透射電鏡可以觀察到突變菌株的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)異常；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)突變菌株對Triton X-100的敏感性顯著降低，分泌自溶素的能力也缺乏，同時突變菌株對作用于細(xì)胞壁的抗生素敏感性增強(qiáng)，提示Stk影響表皮葡萄球菌細(xì)胞壁的代謝。