表皮葡萄球菌聚集相關蛋白(Aap)作為抗細菌生物膜疫苗候選抗原的研究.pdf

1、凝固酶陰性的表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）為人體皮膚表面常見的共生菌，通常不致病。但近年來隨著各種植入性醫(yī)療材料的廣泛使用，表皮葡萄球菌已成為院內(nèi)感染的主要條件致病菌，主要原因是其能在這些醫(yī)療材料表面形成生物膜(biofilm)結構，該結構能夠很好地保護細菌抵抗多種抗生素的治療和人體免疫系統(tǒng)的攻擊，并從中不斷釋放細菌，從而造成機體的反復感染，最終將導致醫(yī)療材料植入的失敗，對患者造成極大的痛苦和對社會

2、造成巨大的經(jīng)濟損失。此外，由于抗生素的大量使用導致表皮葡萄球菌多重耐藥株的發(fā)生率日趨增高，因此急需開發(fā)預防和治療葡萄球菌感染的新方法，尤其是開發(fā)能夠有效抗表皮葡萄球菌生物膜的疫苗。
　　細菌生物膜是細菌粘附在有機或無機材質表面形成的由細菌及大量細胞外粘附分子組成的多層細菌菌落結構。表皮葡萄球菌生物膜的形成主要分為三個階段，初始粘附、增殖聚集及生物膜成熟。在生物膜形成的初始粘附階段，細菌通過大量粘附分子(Adhesin)直接或間接粘

3、附于醫(yī)療材料的表面。當完成初始粘附后，細菌在大量分裂增殖的同時，開始以細菌表面或分泌至細胞外的多種粘附分子為介導，相互粘附并聚集形成一種多層的細菌群落結構。最終，當大量細菌聚集并在醫(yī)療材料表面形成生物膜后，生物膜表面的細菌開始從生物膜上脫落，并隨生物膜外的體液播散至其他部位進而形成新的生物膜。由于在表皮葡萄球菌生物膜形成的過程中，眾多的粘附分子對細菌的粘附和聚集起到了十分重要的作用，因此研究上述細菌粘附分子在生物膜形成中的作用，并研究粘

4、附分子的特異性抗體對細菌粘附聚集能力和生物膜形成能力的影響，便能為抗表皮葡萄球菌生物膜疫苗的研發(fā)奠定基礎。
　　在表皮葡萄球菌生物膜形成的過程當中，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)的能夠介導細菌間相互粘附聚集的粘附分子主要有三大類，多糖細胞間粘附因子(PIA)、蛋白粘附因子、以及細胞外DNA(eDNA)。在這三類粘附分子中，Aap蛋白是一種表達于表皮葡萄球菌細胞壁表面的重要的蛋白粘附分子。Aap蛋白介導的細菌間相互粘附聚集主要是通過其A結構域被蛋白酶水解后

5、，其B結構域在Zn2+存在條件下發(fā)生同源二聚化而實現(xiàn)的。已有文獻報道，針對Aap蛋白的抗體可以有效抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成，因此提示Aap蛋白很可能成為抗表皮葡萄球菌生物膜的候選疫苗。
　　本課題目的是以表皮葡萄球菌Aap蛋白為研究對象，研究其介導表皮葡萄球菌粘附聚集及生物膜形成的關鍵結構域，并通過詳細研究其單克隆抗體對表皮葡萄球菌生物膜形成的影響綜合分析評價Aap蛋白作為抗生物膜疫苗候選抗原的可能性，同時確定Aap蛋白誘導抗

6、生物膜抗體產(chǎn)生的抗原表位，從而為開發(fā)新型的抗葡萄球菌感染的疫苗奠定理論和實踐基礎。
　　第一章表皮葡萄球菌Aap蛋白介導細菌生物膜形成關鍵結構域基本功能單位的確定
　　在表皮葡萄球菌生物膜形成的過程中，Aap蛋白介導的細菌間相互粘附聚集發(fā)揮了極為關鍵的作用，針對Aap蛋白的抗體可以明顯抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成，因此Aap蛋白可以作為抗表皮葡萄球菌生物膜疫苗的候選抗原。然而因Aap蛋白分子量較大(140-300 kDa)，

7、所以利用大腸桿菌原核重組表達全長的Aap蛋白難以實現(xiàn)較高的蛋白產(chǎn)量，導致很難利用全長Aap蛋白制備疫苗;同時由于Aap蛋白是表皮葡萄球菌中的一種優(yōu)勢抗原，直接運用這種來源于細菌的大分子蛋白制備的疫苗安全性較低，難以用于人體的全身免疫?；谏鲜鲈颍肁ap蛋白作為抗原研發(fā)相關的疫苗產(chǎn)品，只能在Aap蛋白中尋找其介導細菌間相互粘附聚集和生物膜形成的關鍵區(qū)域，并且以該區(qū)域為抗原進一步研究其是否能夠誘導動物產(chǎn)生抗生物膜的抗體，從而為后續(xù)的疫

8、苗研發(fā)奠定基礎。通過對Aap蛋白的生物信息學分析，我們發(fā)現(xiàn)Aap蛋白由N端信號肽、A結構域、B結構域、P/G富集結構域和C端的LPXTG細胞壁錨鏈基序組成。在不同的表皮葡萄球菌菌株中，由高度保守的重復元件反復重復串聯(lián)構成的B結構域是Aap蛋白中變異最大的區(qū)域，不同菌株Aap蛋白該區(qū)域含有的重復元件數(shù)量不同，RP62A、ATCC12228和5179株Aap蛋白的B結構域分別含有12個、6個和5個重復元件。利用穿梭質粒pCN51在肉葡萄球菌

9、(Staphylococcuscarnosus)中過表達表皮葡萄球菌ATCC12228株Aap蛋白的B結構域，原本不能形成生物膜的肉葡萄球菌形成了較為明顯的細菌生物膜。說明ATCC12228株Aap蛋白B結構域可以介導細菌生物膜的形成，即使其含有重復元件的數(shù)量不同于生物膜形成陽性菌株RP62A或5179株Aap蛋白B結構域中含有重復元件的數(shù)量。該結果提示，Aap蛋白B結構域正確空間構象的形成及其介導細菌粘附聚集的功能同其含有的重復元件的

10、數(shù)量沒有相關性，各重復元件可能獨立行使功能。進一步克隆、表達、純化“Aap蛋白B結構域最后一個重復元件及其后的不完整重復元件”，即AapBrpt1.5后，利用Native-PAGE和生物膜微孔板半定量實驗分別研究AapBrpt1.5的聚合狀態(tài)及其對表皮葡萄球菌生物膜形成的影響。AapBrpt1.5在Zn2+的介導下可以發(fā)生多聚化，同時AapBrpt1.5還可以競爭性抑制表皮葡萄球菌RP62A株生物膜的形成（抑制作用和濃度成正比）。因此我

11、們認為，B結構域中的每個重復元件都是一個可以在Zn2+介導下發(fā)生多聚化的獨立區(qū)域，AapBrpt1.5是Aap蛋白介導細菌間相互粘附聚集和生物膜形成的基本功能單位。此外，通過AapBrpt1.5免疫小鼠得到免疫血清后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察了小鼠免疫血清對表皮葡萄球菌生物膜形成的影響?？笰apBrpt1.5小鼠血清可以明顯抑制表皮葡萄球菌RP62A株生物膜的形成。AapBrpt1.5作為Aap蛋白介導細菌生物膜形成的基本功能單位，可以

12、代替全長的Aap蛋白作為一個合適的抗原而用于后續(xù)的抗表皮葡萄球菌生物膜疫苗的研發(fā)。
　　第二章表皮葡萄球菌Aap蛋白誘導抗生物膜抗體產(chǎn)生的抗原表位確定
　　既往研究證明，Aap蛋白在表皮葡萄球菌生物膜形成過程中具有非常重要的作用，并且其抗體可以抑制細菌生物膜的形成，提示Aap蛋白可以作為抗生物膜的候選疫苗。但是由于全長Aap蛋白的抗原性過強、分子量過大，限制了其作為疫苗的應用前景。隨著單克隆抗體技術和抗原表位測定技術的發(fā)展，

13、為在Aap蛋白中尋找能夠誘導動物產(chǎn)生抗生物膜抗體的抗原表位提供了有力的條件。這種抗原表位的多肽很有可能成為最佳的抗生物膜的候選疫苗。基于此目的，我們研究了小鼠抗Aap單克隆抗體對表皮葡萄球菌聚集能力和生物膜形成的影響，并測定了各單克隆抗體的抗原表位，為基于該表位的抗生物膜表位多肽疫苗的研發(fā)奠定了基礎。
　　首先，利用Aap蛋白介導生物膜形成的基本功能單位AapBrpt1.5作為抗原，我們制備了小鼠抗Aap單克隆抗體:MAb18B6

14、、MAb25C11和MAb20B9。利用ELISA和Western Blot分別檢測各抗體的效價及抗原識別力等免疫反應性，3株單克隆抗體(IgG)對AapBrpt1.5具有很高的抗原親和力(效價≥1∶1280000/0.4 mg/mL)，同時3株單克隆抗體都可以與表皮葡萄球菌（RP62A和ATCC12228株）Aap蛋白發(fā)生特異性結合。利用蛋白截短聯(lián)合免疫共沉淀法對3株單克隆抗體抗原表位的測定表明，MAb18B6位于AapBrpt1.5

15、中抗原識別位點的序列與表皮葡萄球菌RP62A株Aap蛋白B結構域各重復元件中相應位點的序列完全一致;而MAb25C11和MAb20B9的抗原表位序列僅與RP62A株Aap蛋白B結構域中部分重復元件相應位點的序列完全一致，而在其他重復元件中的相應位置存在有氨基酸殘基的變異。
　　繼而，利用生物膜微孔板半定量實驗和激光共聚焦顯微鏡研究小鼠抗Aap單克隆抗體對表皮葡萄球菌生物膜形成和細菌聚集狀態(tài)的影響，MAb18B6可以抑制表皮葡萄球菌

16、生物膜的形成（抑制率≤40％），但是MAb25C11和MAb20B9卻可以促進細菌生物膜的形成（促進率≤30％）。此外，3株單克隆抗體都可以促使浮游生長的表皮葡萄球菌發(fā)生較為明顯的聚集并形成細菌團塊。結合對3株單克隆抗體抗原表位測定的結果，我們認為不同單克隆抗體對細菌生物膜形成的影響同其識別的抗原表位有關。MAb18B6抗原表位位于表皮葡萄球菌RP62A株Aap蛋白B結構域重復元件中的保守區(qū)域，MAb18B6可以結合并抑制B結構域中各個

17、重復元件的二聚化作用，并抑制分屬于兩個細菌表面的Aap蛋白分子間的拉鏈狀聚合，從而抑制細菌生物膜的形成;而MAb25C11和MAb20B9的抗原表位位于RP62A株Aap蛋白B結構域重復元件中的非保守區(qū)域，它們只能結合并抑制B結構域中部分重復元件的二聚化作用，因此它們對Aap蛋白分子間拉鏈狀聚合的抑制作用明顯低于MAb18B6，從而缺乏對細菌生物膜形成的抑制作用。
　　隨后，分別利用Dot-blot、Western Blot及免疫

18、熒光、熒光定量PCR分別測定表皮葡萄球菌中細胞外粘附因子Aap、eDNA及PIA的生物合成，3株單克隆抗體都可以促進浮游細菌和生物膜表面細菌Aap蛋白的表達，并可以促進生物膜中PIA的合成及eDNA的釋放。這些改變都可以促進細菌間的相互粘附聚集，進而促使浮游的細菌聚集成團，并增強細菌生物膜的形成。
　　因此，小鼠抗Aap單克隆抗體對表皮葡萄球菌細菌間粘附聚集和生物膜形成的影響存在兩種相互矛盾的作用:其一，通過結合Aap蛋白B結構域

19、重復元件中相應區(qū)域而抑制Aap蛋白二聚化并抑制細菌生物膜的形成;其二，通過影響細菌細胞外粘附因子的生物合成而促進細菌生物膜的形成。MAb25C11和MAb20B9本身缺乏對Aap蛋白二聚化的抑制能力，同時又上調了細菌細胞外粘附因子的生物合成，所以其對生物膜形成的作用最終表現(xiàn)為促進;MAb18B6雖然同樣可以上調細菌細胞外粘附因子的生物合成，但是由于其具有較強的阻斷Aap蛋白二聚化的能力，所以上調了的細胞外粘附因子的生物合成只是削弱了其對

20、生物膜形成的抑制作用，MAb18B6最終顯示出對生物膜形成的抑制。所以只有選擇合適的Aap表位多肽作為疫苗，誘導產(chǎn)生具有較強抑制生物膜作用的抗體，才能達到預防生物膜形成的目的;反之，不適當?shù)谋砦灰呙缯T導產(chǎn)生的抗體反而可能會增強細菌生物膜的形成。本論文中的單克隆抗體MAb18B6在體外可以抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成，提示其表位多肽可能在動物體內(nèi)誘導產(chǎn)生抗生物膜的抗體。MAb18B6表位多肽具有潛力用于抗生物膜疫苗的研發(fā)。
　　本論