丹參酮對表皮葡萄球菌生物膜形成的干預(yù)作用及機制初探.pdf

1、目的：
　　表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis，SE)已位于醫(yī)院感染病原體的第四位，研究表明生物膜是該菌致病、難以治愈、容易復(fù)發(fā)的主要原因。目前臨床多是采用大劑量的抗生素治療此類感染，造成了該菌普遍存在耐藥性。而中藥不易造成細(xì)菌耐藥，是我國新藥開發(fā)的優(yōu)勢所在。故本實驗擬從丹參酮中篩選出對生物膜耐藥的SE具有較強抑制作用的單體，探討該單體成分對SE生物膜形成的干預(yù)作用及其分子機制，為臨床選擇丹參酮輔助

2、用于SE生物膜感染的預(yù)防和治療提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.測定總丹參酮及其主要單體成分丹參酮I、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、二氫丹參酮Ⅰ對SE的MIC和MBIC，篩選對生物膜耐藥的SE具有較強抑制作用的單體。
　　2.通過體外構(gòu)建生物膜模型，采用半定量黏附實驗和XTT實驗(2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tet

3、razolium hydroxide)繪制SE生物膜的生長曲線，據(jù)此確定生物膜黏附、聚集、成熟階段的時間點。以萬古霉素為對照藥物，采用半定量黏附實驗、XTT實驗、掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)檢測10MIC以上或1/2MIC濃度的藥物單體干預(yù)下不同階段SE生物膜基質(zhì)形成、膜內(nèi)細(xì)菌代謝活性、生物膜整體微觀形態(tài)的變化，觀察藥物作用生物膜的時間效應(yīng)和劑量效應(yīng)，研究單體成分對SE生物膜形成的表

4、型影響。
　　3.以萬古霉素為對照藥物，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測10MIC以上或1/2MIC濃度的藥物單體干預(yù)下不同階段SE生物膜形成中關(guān)鍵基因（icaA、atlE、aap、luxS）表達(dá)的變化，研究基因、藥物與生物膜形成之間的關(guān)系，探尋藥物單體成分影響SE生物膜形成中關(guān)鍵基因表達(dá)的分子機制。
　　結(jié)果：
　　1.篩選出對生物膜耐藥的SE具有較強抑制作用的單體為隱丹參酮，其MIC和MBIC分別是2μg/mL和32μg

5、/mL。
　　2.通過建立SE生物膜生長曲線，確定了SE生物膜形成的黏附、聚集和成熟階段分別為6h、24h和48h時間點。對于SE1457和SE臨床菌株黏附階段生物膜，32μg/mL的萬古霉素與128μg/mL和32μg/mL的隱丹參酮均能明顯抑制其生物膜基質(zhì)形成和殺滅其膜內(nèi)菌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），同時均能破壞其微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)，并且128μg/mL的隱丹參酮抑制作用優(yōu)于32μg/mL的隱丹參酮，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0

6、.05）。對于SE1457和SE臨床菌株聚集與成熟階段生物膜，32μg/mL的萬古霉素與128μg/mL的隱丹參酮能抑制其生物膜基質(zhì)形成和殺滅其膜內(nèi)菌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），同時均能破壞其微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)，而32μg/mL的隱丹參酮則無明顯抑制效果。
　　3.對于未進(jìn)入生物膜生長階段但具有生物膜形成能力的SE1457和SE臨床菌株，2μg/mL的萬古霉素與1μg/mL的隱丹參酮均能通過抑制其初始黏附能力使其隨后形成的生物膜

7、基質(zhì)量和膜內(nèi)菌代謝活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），并且1μg/mL的隱丹參酮抑制作用明顯優(yōu)于2μg/mL的萬古霉素，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.對于SE1457和SE臨床菌株黏附與聚集階段生物膜，32μg/mL的萬古霉素與128μg/mL的隱丹參酮均能明顯抑制生物膜形成中關(guān)鍵基因（icaA、atlE、aap、luxS）的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。對于SE1457和SE臨床菌株成熟階段生

8、物膜，僅128μg/mL的隱丹參酮能明顯抑制生物膜形成中關(guān)鍵基因（icaA、atlE、aap、luxS）的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而32μg/mL的萬古霉素與32μg/mL的隱丹參酮則無明顯抑制作用（P＞0.05）。
　　5.對于未進(jìn)入生物膜生長階段但具有生物膜形成能力的SE1457和SE臨床菌株，1μg/mL的隱丹參酮能夠明顯抑制其初始黏附能力進(jìn)而抑制其隨后的生物膜形成中關(guān)鍵基因（icaA、atlE、aap、lu

9、xS）的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），并且這種抑制作用明顯強于2μg/mL的萬古霉素，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.10MIC以上隱丹參酮能夠通過抑制生物膜基質(zhì)形成、殺滅生物膜膜內(nèi)菌、破壞生物膜完整結(jié)構(gòu)而對各階段SE生物膜表現(xiàn)一定的清除能力，其分子機制可能是通過下調(diào)生物膜形成中關(guān)鍵基因（ica、atlE、aap、luxS）的表達(dá)而影響生物膜形成中發(fā)揮重要作用的蛋白實現(xiàn)的。并且這種清除能力依