超聲微泡聯(lián)合萬古霉素對表皮葡萄球菌生物膜的干預作用及機制研究.pdf

1、第一部分臨床分離表皮葡萄球菌的產(chǎn)生物膜特性及序列分型
　　[目的]表皮葡萄球菌是醫(yī)院感染尤其是材料相關性感染的主要致病菌。本研究選取臨床分離的表皮葡萄球菌菌株，分析生物膜（biofilm，BF）陽性菌株和BF陰性菌株在表型和基因型上的差別，以說明BF對表皮葡萄球菌致病的重要性。
　　[方法]收集德國維爾茨堡大學附屬兒童醫(yī)院2013年10月至2014年1月送檢靜脈導管及血標本中分離出的5株表皮葡萄球菌菌株。VITEK(@)2

2、Compact藥敏分析系統(tǒng)分析菌株的耐藥譜、剛果紅定性實驗和結晶紫半定量粘附實驗分析菌株的產(chǎn)BF能力、聚合酶鏈式反應檢測菌株的BF相關基因icaA及IS256的表達。采用多位點序列分型技術對菌株進行病原學分型，并將獲得的序列型（sequence type，ST）與表皮葡萄球菌數(shù)據(jù)庫的eBURST遺傳進化圖進行對照。
　　[結果]BF陽性菌株與陰性菌株在表型及基因型上存在明顯差別。同BF陰性菌株相比，BF陽性菌株耐藥譜更廣、對材料表

3、面的粘附力更強。病原學分型顯示BF陽性菌株與BF陰性菌株分別屬于ST2和ST10，前者基因icaA和IS256的表達水平高于后者。eBURST遺傳進化圖顯示ST2是全球多地傳播的表皮葡萄球菌的源ST。
　　[結論]BF陽性菌株因其特殊表型和遺傳變異性，能有效抵御來自醫(yī)院環(huán)境的不良應激因素，成為醫(yī)院感染的主要致病菌。
　　第二部分超聲微泡干預表皮葡萄球菌BF的體外實驗裝置的建立
　　[目的]建立一種超聲微泡干預表皮葡萄球

4、菌BF的體外實驗裝置。
　　[方法]采用表皮葡萄球菌標準菌株ATCC35984(RP62A)，稀釋平板計數(shù)法繪制菌液濃度與光密度值的標準曲線。將10ml接種菌液注入OpticellTM1100細胞培養(yǎng)裝置中建立表皮葡萄球菌BF體外模型，快速銀染法及掃描電鏡鑒定BF的形成。采用超聲振蕩法制備超聲微泡，微泡注入OpticellTM內(nèi)腔后將OpticellTM倒置于超聲水箱中，超聲波經(jīng)脫氣水、聚苯乙烯薄膜及培養(yǎng)基作用于緊密接觸的微泡層和

5、BF層。
　　[結果]表皮葡萄球菌菌液濃度與光密度值呈線性相關，接種菌液濃度約為每毫升2×108集落形成單位(colony forming unit，CFU)。超聲振蕩法制備的脂質微泡濃度約1.2×109/ml，直徑為4-6μm。OpticellTM裝置可用于體外培養(yǎng)細菌BF，以OpticellTM為基礎組建的超聲水箱系統(tǒng)減少了超聲波的衰減，同時BF層和微泡層緊密接觸、使實驗的準確性顯著提高。
　　[結論]本部分實驗利用傳統(tǒng)

6、的細胞培養(yǎng)裝置OpticellTM成功的建立了一種有效的用超聲微泡干預表皮葡萄球菌BF的體外實驗裝置。
　　第三部分超聲微泡聯(lián)合萬古霉素對表皮葡萄球菌BF的協(xié)同殺菌作用
　　[目的]以BF為研究對象進行抗生素藥敏試驗，探討超聲微泡與萬古霉素之間是否存在協(xié)同殺菌作用。
　　[方法]在OpticellTM裝置中培養(yǎng)表皮葡萄球菌BF，采用稀釋平板計數(shù)法檢測空白對照組、單獨超聲組、單獨微泡組、超聲+低濃度微泡(1％，v/v)組

7、及超聲+高濃度微泡(4％，v/v)組中BF活菌數(shù)量的差異。微量肉湯稀釋法測定萬古霉素對浮游細菌的最小抑菌濃度(minimalinhibitory concentration，MIC)，并以細菌BF為研究對象測定萬古霉素在上述不同干預方式下的最小生物膜抑制濃度(biofilm inhibitoryconcentration, BIC)。
　　[結果]空白對照組BF中的活菌數(shù)為8.028±0.043 log10 CFU/cm2，在無抗

8、生素作用時超聲+低濃度微泡對BF細菌無顯著殺滅作用（8.041±0.0491og10 CFU/cm2），而超聲+高濃度微泡能減少BF中的活菌數(shù)量至7.949±0.012 log10 CFU/cm2(P＜0.05)。萬古霉素對浮游細菌的MIC為2μg/ml，對細菌BF的BIC為512μg/ml，單純超聲可將BIC降至128μg/ml，而超聲+微泡能進一步降低BIC至16μg/ml，超聲微泡對萬古霉素的協(xié)同殺菌效應與微泡濃度呈正相關。

9、>　　[結論]BF細菌對萬古霉素的抵抗性較浮游細菌高數(shù)百倍，超聲介導下的微泡能協(xié)同萬古霉素發(fā)揮殺菌作用。
　　第四部分超聲微泡聯(lián)合萬古霉素對表皮葡萄球菌BF體外干預作用的定性與定量分析
　　[目的]探討超聲微泡聯(lián)合萬古霉素對體外表皮葡萄球菌BF的活菌數(shù)量、結構和形態(tài)的影響。
　　[方法]OpticellTM裝置培養(yǎng)表皮葡萄球菌BF，設空白對照組、單獨微泡組、單獨超聲組、超聲+微泡組、單獨萬古霉素組、微泡+萬古霉素組、超

10、聲+萬古霉素組及超聲+微泡+萬古霉素組，微泡濃度包括低濃度(1％，v/v)和高濃度(4％，v/v)兩個參數(shù)。超聲工作頻率為300KHz、能量為0.5W/cm2、脈沖周期為1∶1、工作時間為5min。萬古霉素的干預濃度為32μg/ml，干預時間為24小時。分別采用平板計數(shù)法、掃描電鏡（scanning electron microscopy, SEM）及激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy

11、, CLSM)分析各干預組中BF的活菌數(shù)量及形態(tài)結構。
　　[結果]在無超聲介導時脂質微泡本身無殺菌作用。與空白對照組比較，超聲+萬古霉素能顯著減少BF中的活菌比例至38.98％±3.95％（P＜0.05），加入微泡后該殺菌效應進一步增強，且高濃度微泡的殺菌作用較低濃度微泡更為顯著（6.10％±1.31％ vs22.29％±2.99％, P＜0.05）。在所有干預方式中，超聲+微泡+萬古霉素對BF結構的破壞作用最大，能顯著減少BF

12、的厚度、增大BF孔徑并使BF的三維結構趨于簡單。掃描電鏡觀察到超聲+微泡干預后BF中部分細菌被破壞，可見團塊狀細菌殘骸，經(jīng)高濃度超聲微泡作用后的BF中細菌殘骸較低濃度超聲微泡組增多。
　　[結論]超聲介導下的微泡能破壞表皮葡萄球菌BF的形態(tài)和結構，進而增強萬古霉素對BF的殺菌作用。
　　第五部分超聲微泡干預表皮葡萄球菌BF的物理及生化機制
　　[目的]從物理作用及生化作用兩個方面對超聲微泡產(chǎn)生聲生物效應的機制進行探討。

13、
　　[方法]OpticellTM裝置培養(yǎng)表皮葡萄球菌BF，采用激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy, CLSM)定性觀察經(jīng)超聲+微泡干預后BF細菌對大分子熒光染料的攝取情況，以間接證實“聲致穿孔效應”。超聲或超聲+微泡干預BF后，紙片擴散法測定12h內(nèi)BF胞外基質對萬古霉素分子的通透性的變化趨勢。設空白對照組、單獨超聲組、超聲+低濃度微泡組(1％，v/v)、超聲+高濃度微泡組(4

14、％，v/v)、單獨萬古霉素組、超聲+萬古霉素組、超聲+低濃度微泡+萬古霉素組及超聲+高濃度微泡+萬古霉素組，采用實時熒光定量PCR法測定表皮葡萄球菌BF調(diào)控系統(tǒng)的重要基因agrB、RNAⅢ和icaA在不同干預組中的mRNA表達情況。
　　[結果]空白對照組中大分子熒光染料不易通過細菌胞膜，CLSM下僅見稀疏點狀熒光。經(jīng)超聲+微泡干預后胞膜通透性增大使得較多熒光染料分子進入胞內(nèi)，且染料的胞內(nèi)轉運與微泡濃度相關。BF為影響萬古霉素分子

15、通過聚苯乙烯薄膜的限速步驟，有BF的聚苯乙烯膜與空白聚苯乙烯膜在第12h末通過的抗生素量分別為負荷量的41.47％±1.6％和64.57％±4.19％(P＜0.05)，予以超聲+微泡干預后通過BF的抗生素量在所有時間點均顯著增加，且該促滲效應較單獨超聲干預更強。單獨萬古霉素干預后agrB和RNAⅢ兩個基因的表達量分別為空白對照組的1.12倍及1.25倍（P＜0.05），同時icaA基因的表達量下降至空白對照組的0.87(P＜0.05)。

16、與空白對照組比較，超聲+高濃度微泡+萬古霉素使agrB和RNAⅢ兩個基因的表達水平分別增加至空白對照組的1.40倍及1.35倍(P＜0.05)，同時icaA基因的表達量下降至空白對照組的0.67(P＜0.05)。超聲+微泡+萬古霉素組較超聲+萬古霉素組對基因agrB和RNAⅢ的上調(diào)作用以及對icaA的抑制作用更加顯著（P＜0.05）。
　　[結論]超聲微泡可增加細菌胞膜及BF胞外基質對萬古霉素分子的通透性，同時還可干擾BF的信號調(diào)

17、控系統(tǒng)，使BF相關基因agrB和RNAⅢ的表達上調(diào)、icaA的表達下調(diào)。在超聲微泡干預細菌BF的過程中物理機制與生化機制共同參與，協(xié)同萬古霉素發(fā)揮殺菌作用。
　　第六部分超聲微泡聯(lián)合萬古霉素對表皮葡萄球菌BF的體內(nèi)干預作用
　　[目的]建立動物皮下內(nèi)置材料表面BF相關性感染的體內(nèi)模型，探討超聲微泡聯(lián)合萬古霉素對體內(nèi)表皮葡萄球菌BF的干預作用。
　　[方法]將長有表皮葡萄球菌BF的聚四氟乙烯導管植入實驗兔脊柱兩側的皮下隧

18、道內(nèi)，采用自身對照法設置空白對照組、單獨超聲組、超聲+微泡組、萬古霉素組、超聲+萬古霉素組及超聲+微泡+萬古霉素組。干預結束后處死動物，將皮下植入材料取出，采用掃描電鏡(scanning electron microscopy, SEM)觀察不同干預組中導管表面的BF、稀釋平板法測定BF中的活菌數(shù)，并對植入材料周圍的皮下組織行病理組織學檢查。
　　[結果]導管在植入動物皮下前菌荷量為7.284±0.032 log10CFU/cat

19、heter?？瞻讓φ战M、單獨超聲組、超聲+微泡組、萬古霉素組、超聲+萬古霉素組及超聲+微泡+萬古霉素組中BF活菌數(shù)分別為6.436±0.033 log10 CFU/catheter、6.464±0.066 log10 CFU/catheter、6.440±0.048 log10 CFU/catheter、5.395±0.032 log10 CFU/catheter、5.152±0.035 log10 CFU/catheter及3.493

20、±0.021 log10 CFU/catheter，同超聲+萬古霉素組相比，超聲+微泡+萬古霉素的殺菌作用更為顯著(P＜0.05)。SEM見萬古霉素干預后BF結構變得疏松、細菌數(shù)量減少，單獨超聲+萬古霉素可破壞BF的三維結構，僅余不規(guī)則分布的細菌團塊，超聲+微泡+抗生素組中僅見散在分布的數(shù)個細菌。病理組織學檢查提示超聲微泡聯(lián)合萬古霉素作用后可使動物皮下內(nèi)置材料周圍的炎癥反應減輕，且未對正常皮下組織造成明顯損傷。
　　[結論]本部分