5-氨基酮戊酸光動(dòng)力(ALA-PDT)對(duì)表皮葡萄球菌浮游菌和生物膜抗菌效應(yīng)研究.pdf

1、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)是人體皮膚和粘膜上定居的正常菌群之一,通常情況下致病力較弱。隨著各種有創(chuàng)性治療方法的開展及人口老齡化、免疫力低下人群的出現(xiàn)等,凝固酶陰性的葡萄球菌尤其是表皮葡萄球菌引起的院內(nèi)感染發(fā)生率呈逐年增高趨勢(shì),甚至已經(jīng)超過金黃色葡萄球菌,成為院內(nèi)感染的重要致病菌之一。據(jù)報(bào)道,在皮膚及軟組織感染、燒傷創(chuàng)面、潰瘍及濕疹皮炎等部位極易引起表皮葡萄球菌感染,表皮葡萄球菌之所以成為目前關(guān)注的重點(diǎn),是因?yàn)楸砥て咸亚蚓?/p>

2、可以粘附于物體或病灶表面形成生物膜(Bacterial biofilm,BBF)而致病。BBF可以保護(hù)內(nèi)部細(xì)菌逃避抗菌藥物及宿主免疫殺傷,而且生物膜持續(xù)釋放細(xì)菌進(jìn)入血流引起感染的慢性及反復(fù)發(fā)作,臨床常規(guī)抗感染治療難以湊效。
　　光動(dòng)力療法( photodynamic therapy, PDT)是一種新型的非侵入性治療手段,通過光敏劑選擇性聚集于靶細(xì)胞,在相應(yīng)波長光源照射下,組織細(xì)胞產(chǎn)生單線態(tài)氧和自由基等細(xì)胞毒性物質(zhì)從而對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生

3、選擇性殺傷作用。20世紀(jì)90年代以前,PDT的研究主要集中于腫瘤的診斷和治療,在近20年的皮膚科臨床研究與應(yīng)用中,該技術(shù)愈加成熟與完善。近年來,隨著新型光敏劑的出現(xiàn)和應(yīng)用,以及治療技術(shù)的改進(jìn),在非腫瘤性疾病特別是細(xì)菌性疾病和病毒性疾病的治療上PDT也取得了顯著的療效。國外已有學(xué)者采用不同的光敏劑進(jìn)行PDT抗菌研究,并取得了良好的抑菌效果,但尚未見ALA-PDT對(duì)表皮葡萄球菌浮游菌及生物膜相關(guān)抗菌研究。由于實(shí)驗(yàn)條件、光敏劑及光源的不同,所

4、報(bào)道的PDT治療參數(shù)差別較大。本課題從ALA在細(xì)菌體內(nèi)的熒光藥代動(dòng)力學(xué)開始,研究表皮葡萄球菌對(duì)ALA的吸收和轉(zhuǎn)化為原卟啉IX(Protopophrin IX,PpIX)的情況,尋找PpIX的峰值時(shí)間,確定最佳照光時(shí)間點(diǎn);進(jìn)一步探討ALA-PDT對(duì)表皮葡萄球菌浮游菌及生物膜的抗菌效應(yīng),尋找最佳光敏劑濃度和光照劑量。
　　目的：
　　1、研究ALA在細(xì)菌體內(nèi)轉(zhuǎn)化為PpIX的熒光藥代動(dòng)力學(xué),確定最佳敷藥時(shí)間。2、探討不同藥物濃度和

5、不同光照劑量的ALA-PDT對(duì)表皮葡萄球菌浮游菌抗菌效應(yīng),建立有關(guān)ALA-PDT治療細(xì)菌感染的最佳參數(shù),如: ALA藥物濃度及照光劑量。
　　3、建立細(xì)菌生物膜研究模型,為進(jìn)一步研究ALA-PDT對(duì)細(xì)菌生物膜抗菌效應(yīng)提供研究模型。
　　4、探討ALA-PDT對(duì)細(xì)菌生物膜的抗菌效應(yīng),建立ALA-PDT治療細(xì)菌生物膜感染的最佳參數(shù),如:ALA藥物濃度及照光劑量。
　　方法：
　　1、明確PpIX熒光強(qiáng)度與敷藥時(shí)間和藥

6、物濃度的關(guān)系。
　　實(shí)驗(yàn)分為三組:第一組采用50mM ALA與表皮葡萄球菌37℃,避光共孵育3、5、8、12、16、18、20、24h后,CLSM檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的PpIX熒光強(qiáng)度,明確相同濃度的 ALA在細(xì)菌體內(nèi)轉(zhuǎn)化為 PpIX的熒光強(qiáng)度是否和孵育時(shí)間有關(guān);第二組采用不同濃度 ALA(10、20、30、40、50mM)與細(xì)菌37℃,避光共孵育16h后,CLSM檢測(cè)PpIX熒光強(qiáng)度,明確不同濃度ALA孵育相同時(shí)間后,在細(xì)菌體內(nèi)轉(zhuǎn)化為

7、 PpIX的熒光強(qiáng)度是否與藥物濃度有關(guān);第三組為陰性對(duì)照組(不加ALA),避光共孵育24h后,CLSM檢測(cè)PpIX熒光強(qiáng)度,明確表皮葡萄球菌是否含有內(nèi)源性PpIX。
　　2、確定ALA-PDT對(duì)表皮葡萄球菌浮游菌抗菌效應(yīng)相關(guān)參數(shù)(光照劑量和藥物濃度)。
　　實(shí)驗(yàn)分為三組:第一組采用50mM ALA與表皮葡萄球菌37℃,避光共孵育16h后給予不同劑量(30、50、70、90、100J/cm2)的紅光照射;第二組采用不同濃度 A

8、LA(10、20、30、40、50mM)與細(xì)菌37℃,避光共孵育16h后,給予100J/cm2的紅光照射;第三組為陰性對(duì)照組,采用單純 TSB培養(yǎng)基(不加ALA)培養(yǎng)細(xì)菌16h,不進(jìn)行光照處理。三組標(biāo)本均通過菌落計(jì)數(shù)法分析 ALA-PDT對(duì)表皮葡萄球菌浮游菌的抗菌效應(yīng),明確 ALA-PDT對(duì)表皮葡萄球菌浮游菌抗菌作用的最佳藥物濃度和照光劑量。
　　3、建立細(xì)菌生物膜研究模型。
　　采用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,蓋玻片上形成生物膜,熒

9、光技術(shù)標(biāo)記細(xì)菌,結(jié)合 CLSM觀察生物膜的形成情況,為進(jìn)一步研究 ALA-PDT對(duì)細(xì)菌生物膜的抗菌效應(yīng)提供研究模型。
　　4、探討ALA-PDT對(duì)細(xì)菌生物膜的抗菌效應(yīng)。
　　實(shí)驗(yàn)分為治療組和對(duì)照組,治療組生物膜制備的同時(shí)加入 ALA孵育,培養(yǎng)16h后給予不同劑量(100-300J/cm2)的紅光照射。對(duì)照組不加 ALA,培養(yǎng)16h,不進(jìn)行光照處理。兩組分別通過菌落計(jì)數(shù)法分析 ALA-PDT對(duì)細(xì)菌生物膜抗菌作用;CLSM檢測(cè)

10、ALA-PDT對(duì)細(xì)菌生物膜活力的影響;SEM檢測(cè) ALA-PDT對(duì)細(xì)菌生物膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。
　　結(jié)果：
　　1、PpIX熒光強(qiáng)度與敷藥時(shí)間和藥物濃度的關(guān)系
　　第一組,50mMALA與細(xì)菌37℃,避光共孵育3、5、8、12、16、18、20、24h后,CLSM下均觀察到 PpIX磚紅色熒光,熒光強(qiáng)度隨著孵育時(shí)間的延長而逐漸增強(qiáng),孵育16、18、20、24h的熒光強(qiáng)度明顯高于3、5、8、12h(p﹤0.05);第二組,

11、10、20、30、40、50mM的ALA與細(xì)菌37℃,避光共孵育16h后,CLSM下均觀察到 PpIX磚紅色熒光,PpIX熒光強(qiáng)度隨著 ALA濃度的增加而增強(qiáng),50mM濃度組PpIX熒光強(qiáng)度明顯高于10、20、30、40mM濃度組(p﹤0.05);第三組,單純TSB培養(yǎng)基不加ALA與細(xì)菌37℃,避光共孵育24h后,未見PpIX磚紅色熒光。
　　2、不同光照劑量和藥物濃度的ALA-PDT對(duì)表皮葡萄球菌浮游菌抗菌作用
　　第一組

12、,隨著光照劑量的增加(30、50、70、90、100J/cm2),存活的細(xì)菌數(shù)逐漸減少,當(dāng)光照劑量達(dá)到100J/cm2時(shí),無菌落生長。各劑量組療效與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p﹤0.01),各劑量組療效兩兩比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p﹤0.01)。第二組:隨著 ALA濃度的增加(10、20、30、40、50mM),存活的細(xì)菌數(shù)量逐漸減少,50mM ALA組無菌落生長。各濃度組療效與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p﹤0.01),各濃度組

13、療效兩兩比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p﹤0.01)。
　　3、生物膜制備結(jié)果
　　表皮葡萄球菌(ATCC35984)培養(yǎng)16h后形成且肉眼可見灰白色、膜狀物,平鋪在蓋玻片上,經(jīng)熒光染色后,在 CLSM下觀察,可見該膜狀物呈現(xiàn)綠色熒光,并有一定的厚度,膜內(nèi)細(xì)菌形成致密結(jié)構(gòu),并有許多細(xì)胞聚集成團(tuán),細(xì)胞周圍有許多基質(zhì),并被網(wǎng)狀管道所分隔?？v切面和橫切面上可以觀察到膜表面有少量的浮游菌將掃描表皮葡萄球菌生物膜后得到的數(shù)據(jù),用專業(yè)軟件進(jìn)行

14、處理,得到了表皮葡萄球菌生物膜的三維立體圖像,可形象的觀察到生物膜中細(xì)菌聚集成一團(tuán),像一個(gè)個(gè)小山包,組成了石林一樣的圖像,有些團(tuán)塊中空,像有管道穿入其內(nèi)。這更形象地說明了生物膜具有三維立體的結(jié)構(gòu),且形態(tài)具有多樣、不均質(zhì)、開放的特點(diǎn),這和以前的研究報(bào)道相似,為我們進(jìn)一步研究 ALA-PDT對(duì)表皮葡萄球菌生物膜抗菌效應(yīng)提供了研究模型。
　　4、ALA-PDT對(duì)生物膜細(xì)菌的抗菌效應(yīng)
　　治療組經(jīng)不同劑量的紅光照射后,菌落計(jì)數(shù)法觀察

15、到存活的細(xì)菌數(shù)呈逐漸減少趨勢(shì),經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,各光照劑量組與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),各劑量組兩兩相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);CLSM下觀察到生物膜細(xì)菌活力逐漸降低,死菌/活菌比例逐漸增高,各劑量組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),各劑量組兩兩相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);SEM觀察到生物膜結(jié)構(gòu)疏松,隨著光照劑量的增加,生物膜結(jié)構(gòu)逐漸模糊,當(dāng)光照劑量達(dá)300J/cm2時(shí),生物膜結(jié)構(gòu)消失,多數(shù)

16、細(xì)菌呈單菌落分布。
　　結(jié)論：
　　1、表皮葡萄球菌能很好的吸收ALA并在菌體內(nèi)轉(zhuǎn)化為PpIX,PpIX在CLSM下呈現(xiàn)磚紅色熒光,且熒光強(qiáng)度隨著孵育時(shí)間和 ALA濃度的增加而逐漸增強(qiáng),表皮葡萄球菌本身不含內(nèi)源性的PpIX。
　　2、ALA-PDT對(duì)表皮葡萄球菌浮游菌有明顯的生長抑制作用,當(dāng)達(dá)到最適治療參數(shù)即50mM ALA,孵育16h、100 J/cm2的光劑量,可以滅活浮游表皮葡萄球菌。3、成功制備了表皮葡萄球菌(