5-氨基酮戊酸-光動(dòng)力學(xué)療法作用宮頸癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的 1、研究ALA-PDT在體外對宮頸癌細(xì)胞的生長抑制作用特點(diǎn)，以尋找對ALA-PDT最敏感的宮頸癌細(xì)胞株和影響細(xì)胞增殖的最佳作用參數(shù)。 2、探討ALA-PDT對宮頸癌細(xì)胞的生長抑制機(jī)制，為深入探討光動(dòng)力作用殺傷宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)機(jī)制提供理論依據(jù)。 3、分析ALA-PDT對宮頸癌裸鼠移植瘤的體內(nèi)療效，對不同給藥途徑的PDT治療效果比較，以尋找光毒反應(yīng)最小的給藥方式。 4、結(jié)合體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，探討ALA-

2、PDT誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡的作用途徑。 方法 1、MTT法檢測ALA-PDT對宮頸癌細(xì)胞增殖的影響，并篩選ALA-PDT對宮頸癌細(xì)胞增殖影響的最佳作用參數(shù)。 2、通過直接觀察細(xì)胞形態(tài)、May-Grunwald Giemsa染色、Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡、Hoechst 33342熒光染色結(jié)合熒光顯微鏡觀察ALA-PDT對宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響、流式細(xì)胞儀分析ALA-PDT后細(xì)胞

3、周期變化、Western blot檢測ALA-PDT對宮頸癌細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)的影響、相對實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測ALA-PDT對宮頸癌細(xì)胞RNA的影響，以明確ALA-PDT對宮頸癌細(xì)胞的生長抑制機(jī)制。 3、選擇對ALA-PDT最敏感人宮頸癌Me180細(xì)胞系建立裸鼠宮頸癌移植瘤模型，通過人宮頸癌裸鼠移植瘤體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)、蘇木精-伊紅(HE)常規(guī)染色、免疫組化法檢測ALA-PDT對宮頸癌腫瘤組織Survivin和VEGF蛋

4、白表達(dá)的影響等方法，對局部給藥和尾靜脈給藥兩種給藥方法進(jìn)行比較研究。 4、相對實(shí)時(shí)熒光定量法檢測ALA-PDT對宮頸癌腫瘤組織mRNA的影響，結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果探討ALA-PDT對宮頸癌細(xì)胞的生長抑制機(jī)制和作用途徑。 結(jié)果 1、MTT結(jié)果表明，ALA-PDT在體外對宮頸癌細(xì)胞均有生長抑制作用，其中宮頸癌Me180細(xì)胞株是8種腫瘤細(xì)胞株中對ALA-PDT最敏感的細(xì)胞株，其IC<,50>為6-7×10<'4> M。單獨(dú)

5、使用10 mM以下的ALA對宮頸癌細(xì)胞沒有明顯的毒性反應(yīng)，10-30 J/cm<'2>的激光劑量對宮頸癌細(xì)胞也沒有明顯的毒性。照射后4 h為ALA-PDT作用后的最佳時(shí)間。 2、Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明：ALA-PDT可以顯著的誘導(dǎo)Me180細(xì)胞凋亡，作用后3 h的凋亡主要表現(xiàn)為早期凋亡，到24 h的時(shí)候，早期凋亡率降低，晚期凋亡率增高，總凋亡率降低，考慮為凋亡的時(shí)相問題。ALA-PDT作

6、用后3h，1mM和2mM的ALA-PDT組的總凋亡率增高非常顯著，高達(dá)．52.45％和77.92％。 3、直接觀察細(xì)胞形態(tài)、May-Grunwald和Giemsa染色、Hoechst 33342熒光染色結(jié)合熒光顯微鏡均觀察到細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象。 4、周期分析結(jié)果表明，ALA-PDT作用后4 h，Me180細(xì)胞的周期分布無明顯改變；ALA-PDT作用后24 h，宮頸癌細(xì)胞Me180的周期分布出現(xiàn)了明顯的改變，1 nM～2 nM

7、的ALA-PDT均有顯著的G<,0>-G<,1>期阻滯的作用，S和G<,2>/M期明顯減少。 5、相對實(shí)時(shí)熒光定量法檢測不同組別的凋亡相關(guān)基因Survivin、P53、Bax、Bcl-2、Bad mRNA表達(dá)水平。證明PDT治療后凋亡抑制基因Survivin和Bcl-2的mRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.001)，而促凋亡基因P53、Bax、Bcl-2、Bad mRNA表達(dá)水平稍有增高(P>0.05)。 6、Western

8、 blot檢測結(jié)果表明，ALA-PDT可顯著的抑制Me180細(xì)胞的Survivin蛋白表達(dá)，0.1 mM、1 mM、2 mM的抑制率分別為48.42％、71.22％、73.84％。 7、ALA-PDT對宮頸癌Me180細(xì)胞移植瘤生長的影響：治療后瘤體早期出現(xiàn)發(fā)紅、出血，24小時(shí)后腫瘤表面和切面出現(xiàn)局部壞死和變黑。靜脈給藥PDT組和局部給藥PDT組的腫瘤體積與對照組相比明顯減小，差異有顯著意義(P<0.001)，其中局部給藥PDT

9、、組在7-14天時(shí)體積最小，且體積減小最明顯。 8、HE常規(guī)染色可觀察到：對照組、單純靜脈給藥組、單純局部給藥組、單純激光照射組無明顯變化，而靜脈給藥PDT組和局部給藥PDT組腫瘤受激光照射的皮下細(xì)胞區(qū)域壞死明顯。 9、免疫組化蛋白檢測結(jié)果表明，ALA-PDT可顯著的抑制宮頸移植瘤組織的Survivin和VEGF的蛋白表達(dá)。 10、移植瘤組織mRNA的相對實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果證明PDT治療后凋亡抑制基因Surviv

10、in和Bcl-2的mRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.001)，而促凋亡基因P53、Bax、Bcl-2、Bad mRNA表達(dá)水平稍有增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。 結(jié)論 1、ALA-PDT在體外對宮頸癌細(xì)胞有明顯的生長抑制作用，在一定濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。宮頸癌Me180細(xì)胞株是8種腫瘤細(xì)胞株中對ALA-PDI最敏感的細(xì)胞株。 2、早期誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞株Me180細(xì)胞發(fā)生凋亡是ALA-光動(dòng)