多替泊芬、Photosoft和5-氨基酮戊酸對小鼠S180腫瘤的光動力作用研究.pdf

1、研究背景
　　 癌癥已經(jīng)成為人類的首要死因。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道，2008年全球有760萬人死于癌癥，每年新發(fā)癌癥病例接近1300萬，接近三分之二的死亡病例和新發(fā)病例發(fā)生在發(fā)展中國家。癌癥將是我們必須面對的多發(fā)病和常見病，因此，加強(qiáng)對癌癥預(yù)防和治療的研究成為我們迫切的需求。
　　 光動力療法(Photodynamic Therapy，PDT)是一種非常有前途的腫瘤治療方法，它是利用光化學(xué)反應(yīng)原理，通過特定波長的光

2、激活腫瘤組織內(nèi)滯留的光敏劑，使其與腫瘤組織內(nèi)的氧發(fā)生作用，產(chǎn)生化學(xué)性質(zhì)活潑的單態(tài)氧(1O2)及其他一些活性氧物質(zhì)(radical oxygen species，ROS)，并通過氧化作用攻擊細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸和脂類等生物大分子發(fā)生氧化損傷，當(dāng)氧化損傷的積累超過一定的閾值時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而起到治療作用。PDT包括兩個(gè)步驟:首先全身或局部給予光敏劑，一段時(shí)間后光敏劑選擇性滯留于腫瘤組織中;然后用波長與光敏劑吸收光譜相符的光照射腫瘤局

3、部，滯留在腫瘤組織內(nèi)的光敏劑吸收光后使分子氧轉(zhuǎn)化為以單態(tài)氧為主的ROS，ROS可以通過多種途徑破壞腫瘤組織。由此可知PDT具有兩次選擇性，第一是光敏劑在腫瘤組織的選擇性積聚，第二是光照波長、強(qiáng)度和部位的選擇，使PDT具有相對特異性殺傷腫瘤組織，對正常組織損害小的優(yōu)點(diǎn)。
　　 光動力療法是一種藥械聯(lián)用的腫瘤微創(chuàng)治療方法，在局部或全身給予光敏劑后，使用光導(dǎo)纖維介導(dǎo)激光在體表進(jìn)行照射，或配合內(nèi)鏡在內(nèi)腔器官如氣管、食管、鼻咽部、膽總管和

4、膀胱等進(jìn)行腔內(nèi)照射，也可以在較大的腫瘤組織中行多點(diǎn)穿刺插入光纖進(jìn)行組織間照射。而對于通過手術(shù)方法暴露的腫瘤，如骨腫瘤、腦腫瘤等，也可聯(lián)合PDT行表面照射或在影像設(shè)備輔助下行組織間照射。對于早期、原位的惡性腫瘤可以達(dá)到根治的效果，對于中晚期腫瘤則可作姑息治療，改善患者生存質(zhì)量，延長生存期。與常規(guī)的手術(shù)、放療、化療等療法相比，光動力療法具有創(chuàng)傷小，毒性小，選擇性、適用性、重復(fù)性好，可姑息治療，可消滅隱性病灶，可保護(hù)容貌及重要器官等優(yōu)點(diǎn)，目前

5、已在世界多個(gè)國家獲得批準(zhǔn)應(yīng)用，其適應(yīng)癥包括皮膚癌、食管癌、胃癌、肺癌、頭頸部腫瘤、膀胱癌、婦科腫瘤、鼻咽癌、膽管癌以及癌前病變等，還可以用于眼科等多種非腫瘤疾病的治療。
　　 光動力療法殺傷腫瘤的作用機(jī)制包括:(1)細(xì)胞毒性作用，直接殺傷腫瘤細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞壞死或凋亡;(2)血管毒性作用，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起出血、血栓形成，從而引起腫瘤組織缺乏氧和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，繼而進(jìn)一步引起腫瘤細(xì)胞死亡;(3)在局部誘發(fā)的非特異性炎性反應(yīng)以及

6、后期的一系列免疫反應(yīng)也有抑制和破壞腫瘤的作用。充分闡明PDT的反應(yīng)原理和抗腫瘤機(jī)制，是使PDT更好地應(yīng)用于臨床的基礎(chǔ)前提。
　　 光源、分子氧和光敏劑是PDT的三大要素，其中光敏劑是核心。PDT臨床應(yīng)用亟待解決的問題是新型光敏劑的開發(fā)。理想的光敏劑應(yīng)該具備以下特點(diǎn):(1)在可見光的紅區(qū)(＞650nm)有強(qiáng)吸收;(2)單態(tài)氧和三重態(tài)量子產(chǎn)率高;(3)低暗毒性;(4)在癌組織上可被選擇性吸收，對健康組織，特別是皮膚應(yīng)不吸收或少吸收;

7、(5)容易大量合成，容易保存;(6)根據(jù)藥物動力學(xué)的要求，多余的藥物應(yīng)能很快從體內(nèi)排泄。
　　 探索安全有效的光敏劑是光動力療法更好應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵。Photofrin等進(jìn)口光敏劑價(jià)格昂貴，阻礙了光動力療法在國內(nèi)的普及應(yīng)用。探索研究療效確切，副作用少，價(jià)格便宜，有自主產(chǎn)權(quán)的光敏劑，有利于光動力療法在中國更廣泛地開展。
　　 研究目的：
　　 本研究通過觀察多替泊芬、Photosoft和5-氨基酮戊酸(ALA)這三

8、種光敏劑對小鼠纖維肉瘤的光動力治療療效，并初步探討它們抗腫瘤機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究內(nèi)容和方法：
　　 1.皮下實(shí)體瘤小鼠模型的建立:復(fù)蘇、體外培養(yǎng)S180小鼠纖維肉瘤細(xì)胞，首先于小鼠腹腔種植S180腫瘤細(xì)胞，建立腹水瘤小鼠模型。取腹腔種植腫瘤細(xì)胞7-10天的腹水型荷瘤小鼠，抽取腹水，收集S180腫瘤細(xì)胞，稀釋調(diào)整成細(xì)胞濃度為1×107/ml的細(xì)胞懸液，抽取0.2ml（即2×106個(gè)）混勻的細(xì)胞懸液分別

9、于小鼠雙側(cè)臀部皮下注射，建立皮下實(shí)體瘤小鼠模型。觀察小鼠皮下腫瘤的生長，約5-7天后腫瘤直徑長至5-7mm，即開始行光動力治療。
　　 2.分組與治療:取腫瘤生長良好的昆明小鼠40只隨機(jī)分為以下4組:(1)多替泊芬10mg/kg組;(2) Photosoft20mg/kg組;(3) ALA100mg/kg組;(4)空白對照組。(1)、(2)組小鼠尾靜脈注射光敏劑8-10h后行激光照射，第(3)組尾靜脈注射光敏劑3h后行激光照射;

10、(1)、(3)組使用波長為630nm激光照射（廣西桂林興達(dá)光動力治療儀），第(2)組使用660～795nm激光照射(THECHO GROUP雙頻光動力治療儀)。照光前，用1％戊巴比妥鈉以60mg/kg腹腔注射麻醉小鼠，激光垂直照射腫瘤局部，光斑直徑1.2-1.5cm，保證光斑覆蓋整個(gè)腫瘤，并覆蓋腫瘤四周邊緣約3-5mm的正常組織，功率密度150mW/cm2，能量密度180J/cm2，照光時(shí)間各20min。第(4)組不做任何處理。

11、　　 3.腫瘤大體形態(tài)及體積變化的觀察:治療前及治療后每隔3天觀察腫瘤外觀的變化，拍照記錄，并用游標(biāo)卡尺量度腫瘤長徑(a)與短徑(b)，計(jì)算腫瘤體積(=ab2×1/2)，繪制腫瘤生長曲線，以治療后第21天為觀察終點(diǎn)，計(jì)算抑瘤率（=（對照組平均體積-治療組平均體積）/對照組平均體積×100％)。
　　 4.抗腫瘤機(jī)制的初步探討:各組治療后24h處死5只小鼠，取一側(cè)皮下腫瘤，用眼科剪剪碎，200目細(xì)胞篩過濾，制成細(xì)胞懸液，按照FI

12、TC Annexin V/PI雙染色凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，上流式細(xì)胞儀檢測腫瘤細(xì)胞凋亡、壞死情況。取另一側(cè)皮下腫瘤，常規(guī)福爾馬林固定，脫水，浸蠟，包埋，切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織病理學(xué)變化，并用CD31抗體行免疫組化染色，觀察計(jì)算腫瘤組織血管數(shù)。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所用數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。采用方差分析，多個(gè)樣本均數(shù)間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜

13、0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.腫瘤大體形態(tài)的變化
　　 空白對照組的小鼠的腫瘤逐漸增大，生長速度較快。各治療組腫瘤大體形態(tài)觀察結(jié)果顯示，PDT治療后ALA組皮損最輕，皮膚修復(fù)最快，其次是Photosoft組，皮損較重的是多替泊芬組，部分小鼠直至第21天焦痂未完全褪去。但ALA組抑瘤效果不理想，大多數(shù)的皮下腫瘤繼續(xù)增長，而多替泊芬與Photosoft組抑瘤效果較好，大多數(shù)的皮下腫瘤消失，

14、小部分殘留繼續(xù)生長。
　　 2.腫瘤體積變化及抑瘤率
　　 治療前各組腫瘤體積均數(shù)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。治療后第21天，各治療組與空白對照組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，治療組間Photosoft組與ALA組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.048)。各治療組與空白對照組相比都能抑制腫瘤的生長，其中Photosoft組比ALA組取得更好的療效，而與多替泊芬組效果相當(dāng)。Photosoft組的抑瘤率為75.35％，多替泊芬組

15、的抑瘤率為62.48％，ALA組的抑瘤率為37.17％。
　　 3.腫瘤細(xì)胞凋亡、壞死的比例
　　 從檢測結(jié)果的平均值分析，各治療組的凋亡及壞死的細(xì)胞（包括早期凋亡、晚期凋亡和壞死細(xì)胞）所占比例與空白對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，其中各治療組早期凋亡細(xì)胞所占比例與空白對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。各治療組的凋亡及壞死的細(xì)胞所占比例比空白對照組明顯增多，而正?；罴?xì)胞明顯減少，說明各治療組殺傷腫瘤細(xì)胞效果明顯。<

16、br>　　 4.腫瘤病理組織學(xué)變化
　　 光鏡下觀察，空白對照組的腫瘤組織中央部位有小范圍的壞死，邊緣瘤組織細(xì)胞增殖旺盛，外被有包膜;腫瘤細(xì)胞大而核深染，核漿比例大，核異型性明顯，可見核分裂。各治療組所得結(jié)果相似，從外到內(nèi)可見腫瘤包膜，腫瘤細(xì)胞存活帶，腫瘤細(xì)胞壞死帶，失去細(xì)胞結(jié)構(gòu)的均質(zhì)紅染區(qū)。各治療組可見腫瘤血管內(nèi)紅細(xì)胞淤積，部分血管破裂，紅細(xì)胞外溢，部分血管血栓形成;并可見部分壞死灶周圍有大量中性粒細(xì)胞浸潤。
　　

17、5.各組腫瘤組織的血管數(shù)
　　 各組腫瘤組織在高倍視野(×400)下的血管平均數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果示，多替泊芬組與空白對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000)，Photosoft組與空白對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.005)，ALA組與空白對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.718)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，在PDT治療24h后，多替泊芬組和Photosoft組能引起腫瘤血管數(shù)明顯下降，而ALA組對腫瘤血管數(shù)無明顯影響。
　　 研究結(jié)論：