5-氨基酮戊酸聯(lián)合IPL光動(dòng)力療法對(duì)成纖維細(xì)胞的影響以及相關(guān)分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　 5-氨基酮戊酸聯(lián)合IPL光動(dòng)力療法(5-ALA-IPL-PDT)是近年用于皮膚老化治療的一種方法?，F(xiàn)有的臨床研究顯示IPL光動(dòng)力療法較單純采用IPL照射，在改善皮膚老化的癥狀方面更具療效。但其中涉及的機(jī)制并不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)首先觀察IPL對(duì)小鼠皮膚膠原合成的影響，以及對(duì)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞增殖、膠原分泌表型的影響。為后續(xù)研究摸索實(shí)驗(yàn)條件并觀察功能學(xué)變化。
　　 MAPK是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和存活等功能的信號(hào)網(wǎng)

2、絡(luò)中心。為了研究IPL誘導(dǎo)的增殖與MAPK之間的關(guān)系，我們觀察不同劑量IPL輻照對(duì)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞胞內(nèi)MAPK家族成員ERK、P38、JNK活性影響，以及信號(hào)蛋白活性的時(shí)相性變化。
　　 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白合成的主要刺激因子，而MMP-1是促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白降解的主要活性蛋白。兩者都可由成纖維細(xì)胞分泌，但兩者的功能相反。我們?cè)噲D觀察IPL如何影響兩者的分泌，以及其與細(xì)胞外基質(zhì)合成之間的關(guān)系。
　

3、　 細(xì)胞因子（如:MMP-1、TGF-β1）在IPL嫩膚治療中扮演重要的角色。然而細(xì)胞因子的分泌是首要胞內(nèi)信號(hào)通路的嚴(yán)格調(diào)控，本部分研究著重評(píng)價(jià)MAPK家族成員（ERK、 P38、 JNK）介導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)IPL誘導(dǎo)相關(guān)分泌表型的變化的影響和機(jī)制。
　　 在上述前期研究基礎(chǔ)上，觀察5-氨基酮戊酸聯(lián)合IPL光動(dòng)力療法(5-ALA-IPL-PDT)對(duì)成纖維細(xì)胞MMP-1、TGF-β1分泌影響。同時(shí)探究上述細(xì)胞因子分泌表型變化的信號(hào)

4、機(jī)制，著重研究MAPK家族成員(ERK、P38、JNK)介導(dǎo)的信號(hào)通路在5-ALA-IPL-PDT治療皮膚老化中的作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 在活體實(shí)驗(yàn)中，給予褪毛小鼠梯度能量密度的IPL輻照，在不同時(shí)間點(diǎn)（1，3，7，14和28天）收集小鼠皮膚標(biāo)本，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)皮膚膠原蛋白的改變和成纖維細(xì)胞增殖。
　　 同時(shí)給予體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞梯度能量密度的IPL輻照,在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞周

5、期改變;MTT法確細(xì)胞增殖變化;免疫組織化學(xué)法檢測(cè)膠原蛋白的變化。將成纖維細(xì)胞接種在12孔板中，給予梯度劑量（0、10、18、36和72 J/cm2）的IPL輻射，在輻照后不同時(shí)間點(diǎn)收集提取細(xì)胞全蛋白，Western blot法檢測(cè)ERK、P38和JNK磷酸化水平的變化。人皮膚成纖維細(xì)胞接種培養(yǎng)至12孔培養(yǎng)板，隨后分別給予0、10、18、36和72 J/cm2的梯度劑量IPL輻射，在輻照后24h收集上清， ELISA法檢測(cè)TGF-β1、

6、MMP-1水平的變化。
　　 在干預(yù)研究中，預(yù)先采用PD98059、SB203580和SP600125處理成纖維細(xì)胞，分別阻斷ERK、P38、JNK信號(hào)通路。收集成纖維細(xì)胞，隨后給予IPL輻照。免疫印跡法觀察這些家族成員信號(hào)的變化水平。在照射后24小時(shí)收集上清，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)TGF-β、 MMP-1水平的變化。
　　 成纖維細(xì)胞接種至培養(yǎng)板。在IPL輻照前，預(yù)先采用ALA處理細(xì)胞2小時(shí)，隨后給予成纖維細(xì)胞IPL輻

7、照。MTT法檢測(cè)光動(dòng)力療法的細(xì)胞毒作用，預(yù)設(shè)合適光動(dòng)力參數(shù)。免疫印跡法觀察這些家族成員信號(hào)的變化水平。在照射后24小時(shí)收集上清，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)TGF-β1、MMP-1水平的變化。實(shí)驗(yàn)分組為:空白組、IPL照射組、IPL(10J)+ALA(0.5mM)、IPL(10J)+ALA(1.0mM)。
　　 結(jié)果:
　　 1)給予小鼠32J/CM2的IPL輻照僅輕度增加真皮層的厚度，但真皮膠原纖維的致密性增強(qiáng)

8、。表皮層改變未見顯著改變。IPL照射可促進(jìn)PCNA(增殖細(xì)胞核抗原)的表達(dá)。低劑量IPL輻照體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞并不能明顯促進(jìn)細(xì)胞的增殖。
　　 2)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與無IPL處理組比較，10 J/cm2IPL輻照可輕度激活三者的磷酸化，18-72 J/cm2 IPL輻照可劑量依賴性的抑制ERK、P38和JNK磷酸化，72 J/cm2IPL輻照可最強(qiáng)的抑制這些信號(hào)的活化;時(shí)間組可觀察到，在照光后1小時(shí)ERK、P38、JNK磷酸化水平達(dá)到

9、峰值，隨后三者磷酸化水平降至基礎(chǔ)值之下。
　　 0-36J的IPL輻照對(duì)TGF-β1的分泌沒有明顯的促進(jìn)作用，當(dāng)劑量達(dá)到72 J/cm2時(shí)可觀察到TGF-β1的分泌明顯增加。IPL同時(shí)影響MMP1的分泌，與空白組比較，僅在10J劑量時(shí)可觀察到MMP1分泌輕度增加，而18-72 J/cm2的輻照對(duì)其分泌均未見明顯的影響。
　　 3) PD98059、SP600125預(yù)處理可顯著抑制成纖維細(xì)胞的ERK和JNK磷酸化，SB20

10、3580預(yù)處理未明顯改變P38磷酸化水平;2）與對(duì)照組比較，SP600125可明顯增強(qiáng)MMP-1的水平，平均增高254％。而PD98059、SB203580對(duì)MMP1的分泌無顯著影響;3）SB203580組可觀察到最明顯的TGF-β1分泌，分別為對(duì)照組、PD98059組和SP600125組的329.27％、567％和358％(P＜0.05)。
　　 4)高于18J IPL照射，聯(lián)合ALA濃度高于(0.5mM)預(yù)處理可產(chǎn)生顯著的細(xì)

11、胞毒效應(yīng);據(jù)此我們后續(xù)實(shí)驗(yàn)光動(dòng)力參數(shù)設(shè)為:IPL照劑量10J， ALA濃度為0.5-1.0mM。與空白組比較，IPL(10J)+ALA(0.5mM)組、IPL(10J)+ALA(1.0mM)組，MMP-1濃度分別增加94.7％和111.4％，而TGF-β1濃度分別降低34.8％和39.1％; IPL(10J)+ALA(0.5mM)組可觀察到最明顯的MAPK家族信號(hào)分子活性的增強(qiáng)，灰度分析顯示:與IPL組比較，ERK、P38和JNK分別增

12、加113.1％、36.1％和67.3％(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 本研究顯示IPL輻照可促進(jìn)體內(nèi)外成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白，這一模型的建立為研究IPL嫩膚機(jī)制提供了功能學(xué)依據(jù)。通過觀察IPL對(duì)成纖維細(xì)胞增殖、凋亡、存活生理學(xué)水平的研究，從多個(gè)角度探討IPL嫩膚的潛在信號(hào)分子機(jī)理。
　　 高劑量的IPL輻照可下調(diào)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)蛋白活性。后者對(duì)細(xì)胞增殖和分泌表型產(chǎn)生何種影響需要進(jìn)一步研究。

13、IPL輻照對(duì)TGF-β1、MMP1分泌的影響具有雙向性，高劑量(72J/cm2)輻照可促進(jìn)TGF-β1的分泌，較低劑量(10 J/cm2)促進(jìn)MMP-1的分泌。以上研究為IPL促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖機(jī)理和分泌表型的變化提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　 IPL介導(dǎo)的MMP和TGF的分泌表型變化中，MAPK家族成員發(fā)揮著不同的作用。P38是TGF-β1分泌的負(fù)性調(diào)節(jié)因子;而JNK起上調(diào)作用;ERK對(duì)TGF-β1分泌無影響。JNK可增加MMP-

14、1的表達(dá)，而ERK和P38對(duì)MMP-1分泌無顯著影響。綜合以上部分的研究，我們研究顯示IPL可通過改變MAPK活性影響MMP-1和TGF-β1的分泌。除此之外潛在的替代途徑也發(fā)揮著作用。
　　 5-ALA-IPL-PDT光動(dòng)力療法是對(duì)成纖維細(xì)胞是一種應(yīng)激反應(yīng)，強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)可產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)。在亞細(xì)胞毒劑量范圍內(nèi)，IPL聯(lián)合光動(dòng)力療法顯著改變成纖維細(xì)胞的分泌表型和信號(hào)通路的活化模式。該療法總體上刺激MAPK家族分子(ERK、P38