聲敏劑Sonoflora介導的聲動力治療小鼠S180肉瘤實驗研究.pdf

1、背景：惡性腫瘤已成為危害人類健康和生命的主要疾病之一。據(jù)目前最新調(diào)查結果顯示:我國腫瘤引起的死亡率在所有疾病病因中居第2位(占17.9％)，并且發(fā)病率呈上升趨勢。如何診治腫瘤是目前醫(yī)學界的重大難題之一，繼傳統(tǒng)的手術、化療及放療等治療方式之后，腫瘤的分子靶向治療在現(xiàn)代腫瘤治療模式中產(chǎn)生了劃時代的意義。然而，目前研發(fā)的靶向藥物雖然副作用較小，但只對部分具有特異性靶點的腫瘤療效好，而大部分腫瘤患者的獲益率低。因此，尋找靶向性好、副作用小、總體

2、人群有效率高的惡性腫瘤治療新方法，是腫瘤界面臨的重大課題。聲動力學療法(Sonodynamic therapy，SDT)是在光動力學療法（Photodynamic therapy，PDT）的基礎上發(fā)展起來的一種腫瘤治療新理念，是通過靜脈注射或口服聲敏劑，聲敏劑通過血流靶向性在腫瘤組織中聚集，然后利用低強度的超聲照射腫瘤，以聲能激活聲敏劑，使其在腫瘤局部產(chǎn)生一系列理化反應（如聲致發(fā)熱、單線態(tài)氧、羥自由基等），導致腫瘤細胞不可逆性損傷，而達

3、到抗腫瘤治療的一種新手段。SDT將超聲深部無創(chuàng)穿透能力及精確定位能力與聲敏劑對腫瘤組織的靶向性相結合，確保了對表淺及深部的各種腫痛靶向性治療。因其無創(chuàng)性和靶向性成為腫瘤治療的一種新方法，有著廣闊的發(fā)展前景。但是既往使用的聲敏劑多為血卟啉的衍生物（如HPD、PhotofrinⅡ），存在聲動力效應差、靶向性不高、排泄緩慢，易發(fā)生光敏反應等問題。雖以葉綠素為原料合成的新型聲敏劑如二氫卟吩e4、二氫卟吩e6，克服了血卟啉衍生物的缺點，但國內(nèi)無知

4、識產(chǎn)權，進口價格昂貴，亦限制了其在聲動力治療領域的應用。我們以光合作用強、毒副作用小的葉綠素為原始合成原料，通過計算機模擬分子結構改造、修飾等過程，在葉綠素卟啉母體上引入兩個特定的長鏈型氨基酸基團作為接收聲波的“天線”，合成新型聲敏劑Sonoflora。目前Sonoflora的生物學效應、毒理實驗及光聲譜性質(zhì)已被驗證;但聲敏劑在腫瘤細胞及組織的靶向性聚集、抗腫瘤作用以及安全性，仍未開展。本實驗將通過采用激光共聚焦實驗、腫瘤抑制試驗、血常

5、規(guī)生化檢驗等方法驗證聲敏劑在小鼠S180肉瘤模型中靶向聚集性、抗腫瘤效應、毒副反應等;為最終挑選出高效、低毒且具有自主知識產(chǎn)權的新型聲敏劑奠定實驗基礎，并將推動聲動力治療在臨床腫痛靶向性治療領域的發(fā)展及應用，具有重大的理論意義、社會效益和經(jīng)濟效益。
　　 目的：本研究的第一個目的是采用用共聚焦顯微鏡觀測Sonoflora在小鼠S180肉瘤模型中腫瘤靶向聚集性，探索給藥后最佳的超聲輻射時間。第二個目的是研究Sonoflora聯(lián)合超

6、聲對S180肉瘤的殺傷作用，探索最佳的聲動力治療模式。第三個目的是研究觀察Sonoflora（10、20、40 mg/kg）腹腔注射后3h～72h對S180肉瘤荷瘤小鼠血常規(guī)、生化指標的影響，判斷其安全性。
　　 方法：⑴S180肉瘤細胞株在小鼠腹腔傳代7次，待細胞株生長穩(wěn)定后，取腹腔傳代第8天的S180肉瘤細胞懸液，加無菌生理鹽水，調(diào)節(jié)細胞濃度為1×107個/ml。去除小鼠右側腋毛，取0.2ml細胞懸液接種于小鼠右腋皮下。腋下

7、接種7天后，電了游標卡尺測得腫瘤平均直徑約0.7cm后用于實驗。⑵選取腫瘤大小均一，體重相近的荷瘤小鼠35只，隨機分7組，每組5只。在暗室內(nèi)腹腔注射Sonoflora10mg/Kg，避光避聲飼養(yǎng)，分別于注射后3、6、12、18、24、48、72h斷頸處死荷瘤小鼠，剝離腫瘤和正常肌肉組織，制備冰凍切片，并在激光共聚焦顯微鏡下觀測腫瘤和肌肉組織的熒光顯像及熒光強度（顯示為紅色熒光）。⑶選取腫瘤大小均一，體重相近的荷瘤小鼠50只，隨機分組，每

8、組5只小鼠。(1)對照組(C):腹腔注射無菌生理鹽水組;(2)單純超聲組:聲強分別設定為0.4W/cm2(U1)、0.8W/cm2(U2)、1.6W/cm2(U3);(3)單純Sonoflora組:濃度分別設定為10mg/kg(S1)、20mg/kg(S2)、40mg/kg(S3);(4)超聲+Sonoflora組:Sonoflora濃度定為10 mg/kg，聲強分別設定為0.4W/cm2(S1U1)、0.8W/cm2(S1U2)、1.

9、6W/cm2(S1U3)。在暗室內(nèi)腹腔注射Sonoflora，避光避聲飼養(yǎng)，聲敏劑注射18h后進行超聲處理，超聲輻照時間固定為180s。每2天用電子游標卡尺測量腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。計算腫瘤體積公式:腫瘤體積=π/6[（長徑+寬徑）/2]3。15天后脫頸處死小鼠，剝離腫瘤組織，電子天平稱重，比較瘤體重量。⑷選取腫瘤大小均一，體重相近的荷瘤小鼠140只，隨機分4大組:對照組(C);腹腔注射Sonoflora10mg/kg組;20mg

10、/kg組;40mg/kg組。每大組35只荷瘤小鼠，再隨機分為7組，每小組5只老鼠。避光避聲飼養(yǎng)，并分別于給藥后3、6、12、18、24、48、72h，采用摘眼球取血法取血，放入EDTA血常規(guī)管，取血液約1.5 ml混勻后在2h內(nèi)給予送檢檢驗科，檢測血紅蛋白、紅細胞、白細胞、血小板、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、直接膽紅素、肌酐、尿素氮、乳酸脫氫酶、磷酸肌酸。⑸統(tǒng)計方法:實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，兩組之間比較采

11、用t檢驗，多組之間比較采用one-way ANOVA方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：①腹腔注射后3h后，Sonoflora（10mg/kg）在腫瘤組織中含量開始顯著高于正常肌肉組織(P＜0.05)，持續(xù)至48h。其中18h時Sonoflora在腫瘤和正常肌肉組織含量均達最高峰，且此時差異最明顯，腫瘤組織熒光強度是正常肌肉組織的5.33倍。72h后腫瘤及正常肌肉組織熒光均明顯減弱甚至消失。鑒于18h腫瘤組

12、織聲敏劑含量與正常肌肉含量之比最大，此時若對腫瘤進行輻照處理，既可有效的殺傷腫瘤細胞，又對周圍正常組織損傷較小，我們選用這一時間點進行聲動力實驗。②單獨應用超聲或Sonoflora對腫瘤生長的影響通過對各組小鼠腫瘤體積的生長趨勢及最終腫瘤平均重量的比較可以發(fā)現(xiàn)，單純超聲組0.4 W/cm2(U1)、0.8 W/cm2(U2)、1.6 W/cm2(U3)組，單純Sonoflora10mg/kg(S1)、20mg/kg(S2)、40 mg/

13、kg(S3)組組間比較及與空白對照組(C)對比均無顯著性差異(P＞0.05)。提示單獨使用超聲照射(0.4、0.8、1.6W/cm2)或單獨注射Sonoflora(10、20、40 mg/kg)均不能明顯有效的抑制腫痛生長。③Sonoflora介導的聲動力對S180肉瘤的殺傷作用通過對各組小鼠腫瘤體積的生長趨勢及最終腫瘤平均重量的比較可以發(fā)現(xiàn)，單純0.8 W/cm2超聲組(U2)、單純10mg/kg Sonoflora(S1)與空白對照

14、組(C)對比均無顯著性差異(P＞0.05)，而0.8 W/cm2超聲和10mg/kg Sonoflora聯(lián)合治療組(S1U2)其腫瘤體積及重量較單純超聲(U2)、單純聲敏劑(S1)及對照組(C)顯著減少(P＜0.05)。提示超聲聯(lián)合Sonoflora(10mg/kg+0.8W/cm12)介導的聲動力具有協(xié)同抗腫瘤作用。④Sonoflora介導的聲動力療效與超聲波的強度關系通過對各組小鼠腫瘤體積的生長趨勢及最終腫瘤平均重量的比較可以發(fā)現(xiàn)，

15、3組聲動力組10mg/kg+0.4 W/cm2(S1U1)、10mg/kg+0.8 W/cm2(S1U2)、10mg/kg+1.6 W/cm2(S1U3)與空白對照組(C)對比均有顯著性差異(P＜0.05)，10mg/kg+0.4 W/cm2(S1U1)與10mg/kg+0.8 W/cm2(S1U2)、10mg/kg+1.6 W/cm2(S1U3)對比有顯著性差異(P＜0.05)，而10mg/kg+0.8 W/cm2(S1 U2)與10

16、mg/kg+1.6 W/cm2(S1 U3)對比無顯著性差異(P＞0.05)。提示Sonoflora濃度為10mg/kg情況下，0.4、0.8、1.6W/cm2強度的介導的聲動力均對S180腫瘤生長產(chǎn)生明顯抑制作用(P＜0.05)，而固定Sonoflora濃度為10mg/kg情況下，0.8W/cm2強度介導的聲動力已達最大抑制腫瘤強度。⑤四組瘤荷瘤小鼠的腹腔注射后不同時間點白細胞、紅細胞、血紅蛋白、血小板、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、直接膽

17、紅素、乳酸脫氫酶、磷酸肌酸無顯著性差異(p＞0.05)。Sonoflora40mg/kg腹腔注射后48h、72h的血肌酐與對照組、20mg/kg、10mg/kg組有顯著性差異(p＜0.05);72h的血尿素氮也與對照組、20mg/kg、10mg/kg組有顯著性差異(p＜0.05)。提示Sonoflora濃度40mg/kg腹腔注射對荷瘤小鼠腎功有損害作用，導致血肌酐、尿素氮升高。而10mg/kg、20mg/kg濃度的Sonoflora對荷

18、瘤小鼠血常規(guī)、腎功、肝功、心功的無損害作用。
　　 結論：⑴在S180荷瘤小鼠中，Sonoflora具有腫瘤靶向性好、體內(nèi)代謝快的優(yōu)點;Sonoflora腹腔注射后18h是進行超聲處理的理想時間點。⑵在Sonoflora10mg/kg的濃度下，超聲聯(lián)合Sonoflora顯著抑制小鼠S180肉瘤生長，且0.8W/cm2強度介導的聲動力達最大抑制腫瘤，與1.6 W/cm2無顯著性差別(P＞0.05)。⑶10～20mg/kg濃度的So