亞-MIC大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物對臨床分離表皮葡萄球菌生物膜形成的影響及機理研究.pdf

1、細菌生物膜(bacterial biofilm)是細菌利用自身分泌的含水聚合物質(zhì)黏附成團,附著于固體物質(zhì)表面的具有特殊微結(jié)構的細菌群落。生物膜可形成于多種材料表面,也包括機體組織和植入的醫(yī)療器械,生物膜細菌具備較高的耐藥能力且具有可播散的特點,其引起的感染在臨床上常表現(xiàn)為遷延不愈。表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,S epidermidis)為最常見的凝固酶陰性葡萄球菌(coagulase negati

2、ve staphylococcus,CNS),常于植入的醫(yī)療器械表面形成生物膜,而S epidermidis引起的生物膜感染是目前醫(yī)療器械相關感染的主要原因,對其生物膜感染的防治是現(xiàn)今抗感染研究領域的難點和重點之一。
　　 近年來的一些研究提示,抗菌藥物雖然難以清除生物膜菌,但在亞抑菌濃度(subinhibitory concentration,亞-MIC)下,卻可能有效干擾生物膜的形成,這為有效預防臨床細菌生物膜形成和播散提供

3、了希望。鑒于其具有良好的臨床應用前景,亞-MIC抗生素對細菌生物膜形成的調(diào)控作用開始受到重視。大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物(Macrolides)在體外亞-MIC濃度下顯示了對銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鳥分枝桿菌Mycobacterium avium)等生物膜形成的抑制作用,受到了較多關注。大環(huán)內(nèi)酯類藥物屬廣譜抗菌藥物,在臨床廣泛應用于β-鏈球菌、肺炎鏈球菌、葡萄球菌和腸球菌等病原菌的感染治療,但其亞-MIC濃

4、度甚至常規(guī)治療濃度是否也對這些病原菌生物膜形成有一定的影響?對此現(xiàn)有的研究提示極少。目前也尚未有研究關于亞-MIC大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物對臨床分離Staphylococcus epidermidis生物膜形成的影響。對此進行研究將對進一步了解亞-MIC大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的生物膜調(diào)控機制以及尋找有效防治臨床細菌生物膜感染的有效手段均具有一定的科學意義和現(xiàn)實意義。
　　 在本研究中,利用微孔測定法考察了1/4 MIC紅霉素(erythr

5、omycin,EM)對105株紅霉素耐藥的臨床分離S epidermidis生物膜形成的影響,篩選出了21株生物膜受EM顯著誘導的菌株,繼而考察了三種大環(huán)內(nèi)酯類藥物阿奇霉素(azithromycin,AZM)、克拉霉素(clarithromycin,CAM)和紅霉素對這21株菌生物膜形成的作用。通過PCR法鑒定105株臨床分離S epidermidis的icaA基因型,探討了亞-MIC大環(huán)內(nèi)酯類藥物的作用和icaA基因型的關系,并從中選

6、取出分別為icaA陽性和icaA陰性的菌株Sepidermidis SW029和S epidermidis SW036作進一步的時效和量效研究。在機理研究中以S epidermidis SW029為主要研究對象,首先考察了。EM(8mg/L,1/16 MIC)對其生長的影響,其后通過激光共聚焦顯微鏡以及掃描電子顯微鏡考察了EM對其初始黏附的影響,并觀察了亞-MIC EM作用下S epidermidis SW029細菌生物膜形成的過程。生

7、物膜相關基因icaA,sigB,atlE and sarA的考察以realtime RT-PCR方法進行,在此基礎上選取時間點進一步對S epidermidis SW029全基因組表達譜作對比分析,旨在尋找亞-Mic大環(huán)內(nèi)酯類藥物的作用靶點和可能的作用機制。在研究的最后部分,我們嘗試建立了一種新的細菌生物膜感染的體內(nèi)模型。
　　 研究的主要結(jié)果如下:
　　 1.1/4 MIC EM顯示了對20％臨床分離S epiderm

8、idis生物膜形成的顯著誘導作用,令人關注的是另兩種大環(huán)內(nèi)酯類藥物AZM和CAM顯示了對這20％菌株相似的誘導作用,誘導的幅度與EM顯示了相關性(R2均為0.91)。提示大環(huán)內(nèi)酯類藥物可誘導部分臨床分離S epidermidis菌株的生物膜形成,同時研究顯示生物膜的這種誘導作用和icaA基因型之間沒有必然的聯(lián)系。
　　 2.icaA基因型鑒定結(jié)果顯示基因陽性的菌株生物膜形成能力顯著強于icaA陰性的菌株,但EM的生物膜誘導作用與

9、icaA基因型無關;亞-MIC EM沒有顯示對金黃色葡萄球菌的誘導作用,提示其作用對S epidermidis具特異性。
　　 3.所有三個濃度(1/4,1/16,1/64 Mic)的AZM,CAM和EM顯示了對S epidermidisSW029生物膜形成的顯著誘導作用,并沒有顯示出劑量依賴性。藥物對S epidermidisSW036的生物膜誘導作用則有明顯的劑量依賴性;大環(huán)內(nèi)酯類藥物對這兩株菌的生物膜誘導作用可持續(xù)至48h

10、。
　　 4.EM8mg/L(1/16MIC)在24h內(nèi)可顯著抑制S epidermidis SW029的生長。EM并沒有顯示對其初始黏附的統(tǒng)計學差異。提示藥物的誘導作用可能與細菌初始黏附能力的改變無關。
　　 5.以激光共聚焦顯微鏡和掃描電鏡觀察細菌生物膜的形成過程,EM8mg/L組細菌在12h時多糖開始有顯著分泌,而同一時間點對照組多糖分泌并不明顯,24h兩組多糖分泌均有明顯增加。至48h,通過掃描電鏡觀察到EM組的

11、生物膜開始呈現(xiàn)膜狀包裹的典型的生物膜性狀,于對照組中未發(fā)現(xiàn)。
　　 6.EM8mg/L作用6h,icaA,sigB,atlE和sarA基因與對照組相對基因表達比值分別為1.2,2.0,6.2和1.7倍,至24h相對基因表達比值分別為2.8,0.6,2.4和6.9倍。提示atlE的誘導作用可能是生物膜誘導的重要途徑,而icaA和sarA的誘導從時間點和作用強度分析可能為繼發(fā)性的誘導作用。
　　 7.全基因組表達譜分析顯示,

12、EM8mg/L使S epidermidis SW029基因表達發(fā)生了廣泛的變化,有332個基因發(fā)生了2倍下調(diào),同時395個基因表達發(fā)生了2倍上調(diào),共占所有表達基因的近三分之一,其中一些涉及細菌生長,黏附,細菌外膜的生物合成等生物膜形成相關調(diào)節(jié)基因,而atlE的誘導作用較為顯著,提示atlE基因調(diào)節(jié)可能是調(diào)節(jié)機制之一。由于核糖體蛋白的編碼基因表達幾乎一致受到誘導,我們推測與大環(huán)內(nèi)酯類藥物的抗菌機理一致,亞-MIC大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物作用于核

13、糖體并抑制蛋白質(zhì)合成,但其在較低濃度下仍然能夠發(fā)揮顯著生物膜誘導作用的現(xiàn)象提示藥物與核糖體蛋白的相互作用可能存在結(jié)合位點或基因突變的差異。因此進一步對核糖體蛋白及基因的研究可能有助于研究亞-MIC藥物發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的機制。
　　 8.通過:Babl/c小鼠建立了一種的新的生物膜感染模型。經(jīng)方法學研究,該模型具有微創(chuàng),操作性強,評價直觀等優(yōu)點,并且模型可在一定程度上客觀反應考察菌株生物膜形成能力的差異,但模型建立后的生物膜感染程度的

14、評價方法在特異性上還存在缺陷,還需進一步完善。
　　 本課題研究結(jié)果提示,大環(huán)內(nèi)酯類藥物在亞-MIC濃度下,對臨床分離S epidermidis的生物膜形成總體上存在誘導的趨勢,其機理可能是亞-MIC大環(huán)內(nèi)酯類藥物通過抑制核糖體蛋白質(zhì)合成,繼而影響生物膜相關基因的表達誘導生物膜形成,其中atlE可能起到了重要的作用。近年來葡萄球菌的耐藥率逐年升高,同時大環(huán)內(nèi)酯類藥物在臨床又使用廣泛,而亞-MIC是一個相對量的概念,耐藥菌感染的患

15、者所接受治療的抗菌藥物濃度通常只能達到亞-MIC水平。因此本研究結(jié)果警示,對那些有/潛在S epidermidis生物膜感染的患者,接受大環(huán)內(nèi)酯類藥物治療可能存在一定的風險。
　　 人類利用抗菌藥物(作為殺菌劑或抑菌劑)殺滅或抑制細菌生長,但究其本源,抗菌藥物來源于由細菌合成并釋放的小分子活性物質(zhì),其可為細菌感知并參與調(diào)控一系列生命行為,其中也包括細菌生物膜的形成。鑒于目前對亞-MIC抗菌藥物對細菌生物膜的調(diào)控還知之甚少,尚有許