豬鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物耐藥機(jī)制研究.pdf

1、隨著養(yǎng)豬業(yè)的迅猛發(fā)展，豬鏈球菌病也在世界范圍內(nèi)廣泛傳播。豬鏈球菌病是由豬鏈球菌引起的一種重要人畜共患病，尤其是血清2型豬鏈球菌，不僅對(duì)豬的致病性最強(qiáng)，而且可感染特定人群并致死，給人類(lèi)公共衛(wèi)生和養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大影響。豬鏈球菌病表現(xiàn)為許多臨床癥狀，如腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎以及敗血癥。另外，健康豬只在鼻腔、扁桃體、上呼吸道和支氣管也可以攜帶豬鏈球菌，加速了這種疾病的擴(kuò)散和傳播。 大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物是由鏈霉菌產(chǎn)生的一類(lèi)化學(xué)結(jié)構(gòu)和抗菌作用相近

2、的抗生素，他們都有一個(gè)大內(nèi)酯環(huán)，這個(gè)內(nèi)酯環(huán)通常為12～20元環(huán)。14元環(huán)包括紅霉素、克拉霉素、羅紅霉素；15元環(huán)為阿齊霉素；16元環(huán)有麥迪霉素、螺旋霉素、交沙霉素。獸醫(yī)臨床最常用的是紅霉素和泰樂(lè)菌素。由于大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的臨床應(yīng)用和在飼料中添加預(yù)防亞治療劑量該類(lèi)藥物，其耐藥性也隨之廣泛產(chǎn)生，豬鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)的耐藥率達(dá)50％以上。由于豬鏈球菌耐藥性的產(chǎn)生往往導(dǎo)致治療失敗，且耐藥基因可以在不同種屬細(xì)菌間傳播，引起多重耐藥，后果嚴(yán)重。

3、 豬鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥的機(jī)制主要有三種，一種是結(jié)合靶位的甲基化，可以阻止藥物與靶位的結(jié)合，其主要是由erm基因編碼所產(chǎn)生的；第二種是細(xì)菌細(xì)胞膜的泵機(jī)制，將藥物主動(dòng)外排，使菌體內(nèi)藥物濃度降低，而產(chǎn)生耐藥，其主要是由mef基因編碼所產(chǎn)生的；第三種是核糖體蛋白發(fā)生基因突變，導(dǎo)致耐藥。 由于與抗生素結(jié)合靶位核糖體甲基化，可以導(dǎo)致鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物、林可酰胺類(lèi)藥物以及鏈陽(yáng)菌素B產(chǎn)生交叉耐藥性，所以常把這種耐藥統(tǒng)稱(chēng)為MLS

4、B耐藥表型。甲基化可以導(dǎo)致核糖體50S亞基的構(gòu)象發(fā)生改變，降低結(jié)合效率。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物、林可酰胺類(lèi)藥物及鏈陽(yáng)菌素B可能有相似的結(jié)合位點(diǎn)，產(chǎn)生交叉耐藥。根據(jù)表達(dá)方式的不同，MLS耐藥性又可分為內(nèi)在型(constitutivemacrolidelincosamidestreptogramin，cMLS)和誘導(dǎo)型(induciblemacrolidelincosamidestreptogramin，iMLS)耐藥，ermB基因上游調(diào)控區(qū)決定了

5、ermB的內(nèi)在或誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)14、15、16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物、林可酰胺類(lèi)藥物及鏈陽(yáng)菌素B均耐藥，系cMLS型耐藥菌；對(duì)14、15元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物耐藥，而對(duì)16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物及林可酰胺類(lèi)藥物及鏈陽(yáng)菌素B仍敏感，系iMLS型耐藥菌。誘導(dǎo)耐藥性?xún)H表現(xiàn)為對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物低水平耐藥，一旦耐藥基因ermB被完全誘導(dǎo)表達(dá)，則表現(xiàn)為內(nèi)在耐藥性，即對(duì)所有大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物、林可酰胺類(lèi)藥物和鏈陽(yáng)菌素B高水平耐藥。在肺炎鏈球菌中發(fā)現(xiàn)另一種耐藥表型，對(duì)14

6、、15元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物低水平耐藥而對(duì)16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物、克林酰胺類(lèi)藥物和鏈陽(yáng)菌素B敏感，即M型，其主要介導(dǎo)主動(dòng)外排系統(tǒng)產(chǎn)生耐藥性。耐藥基因mef編碼的外排蛋白是一個(gè)能量依賴(lài)的膜蛋白，由405個(gè)氨基酸組成，含12個(gè)跨膜區(qū)域，mef依靠質(zhì)子運(yùn)動(dòng)力泵出14、15元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物。另外，在肺炎鏈球菌中發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白L4及L22或23SrRNA發(fā)生突變，也可以導(dǎo)致其對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥性。 本試驗(yàn)從河南、黑龍江、遼寧、廣州、上

7、海、湖北、湖南、山東及吉林等全國(guó)各地，采集疑似豬鏈球菌感染豬只病變組織樣本1500余份，包括肺、肝、脾、腎、腦、扁桃體及淋巴結(jié)等，共分離豬鏈球菌52株，其中2型豬鏈球菌3株。用鏈球菌乳膠凝集試劑盒對(duì)分離的豬鏈球菌進(jìn)行蘭氏分群，其中B群8株，C群1株，D群39株，G群1株，未出現(xiàn)凝集3株，說(shuō)明在本試驗(yàn)分離株中以D群為主要菌群，占75％。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物耐藥菌株的篩選，采用微量稀釋法，測(cè)定豬鏈球菌對(duì)其敏感性，共分離對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物耐藥豬鏈球菌

8、27株，結(jié)果紅霉素、泰樂(lè)菌素、阿奇霉素和螺旋霉素耐藥率分別為53.8％、50.0％、51.9％和53.8％；將篩選出耐大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物豬鏈球菌，采用紙片瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定該菌對(duì)其他抗菌藥物敏感度，結(jié)果青霉素G和氨芐西林耐藥率分別為88.9％和81.5％；氯霉素為59.3％；四環(huán)素為96.3％；先鋒5號(hào)為55.6％；頭孢呋新為74.1％；復(fù)方磺胺為100％；氟哌酸為81.5％。采用雙紙片瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定豬鏈球菌耐大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的耐藥表型，結(jié)果耐藥

9、表型均為內(nèi)在型誘導(dǎo)，即cMLS型耐藥表型，未發(fā)現(xiàn)iMLS型和M型耐藥表型。其中有一株耐大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的豬鏈球菌檢測(cè)到ermC基因，有21株耐大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的豬鏈球菌檢測(cè)到ermB基因，ermB基因測(cè)序結(jié)果與Genebank中基因序列同源性均在98％以上，ermC基因測(cè)序結(jié)果與Genebank中基因序列同源性為99.8％，未檢測(cè)到mef基因。Erm耐藥基因檢出率為81.5％，說(shuō)明引起豬鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥的主要原因是由結(jié)合靶位的

10、甲基化引起的。 為闡明豬鏈球菌在單一藥物選擇性壓力下與復(fù)雜選擇性壓力下，對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥機(jī)制的不同，以紅霉素為代表，本試驗(yàn)采用一株對(duì)紅霉素敏感的豬鏈球菌，通過(guò)體內(nèi)和體外誘導(dǎo)耐藥試驗(yàn)進(jìn)行研究。體外誘導(dǎo)耐藥試驗(yàn)分為高濃度和低濃度藥物誘導(dǎo)組，即將細(xì)菌在加有紅霉素的培養(yǎng)基內(nèi)連續(xù)傳代；體內(nèi)誘導(dǎo)耐藥試驗(yàn)分為治療組和預(yù)防組，即在接種豬鏈球菌的兔體內(nèi)進(jìn)行高濃度和低濃度持續(xù)給藥，在不同時(shí)期分離豬鏈球菌，分析其耐藥性及耐藥機(jī)制。結(jié)果表明，體

11、外誘導(dǎo)耐藥試驗(yàn)和體內(nèi)誘導(dǎo)耐藥試驗(yàn)均表明豬鏈球菌在低濃度紅霉素藥物溶液的選擇性壓力下，更容易產(chǎn)生耐藥性。將體外誘導(dǎo)試驗(yàn)誘導(dǎo)后的耐藥株與空白敏感株，通過(guò)電鏡觀(guān)察菌體微細(xì)結(jié)構(gòu)，未見(jiàn)異同。豬鏈球菌體內(nèi)、體外誘導(dǎo)對(duì)紅霉素產(chǎn)生耐藥性主要是通過(guò)ermB基因編碼的甲基化酶產(chǎn)生的。豬鏈球菌的核糖體蛋白發(fā)生突變，可能是造成豬鏈球菌對(duì)紅霉素耐藥的原因之一。 本試驗(yàn)還通過(guò)表達(dá)ermB基因，尋找核糖體甲基化酶抑制劑，擬解決由于結(jié)合靶位改變而導(dǎo)致豬鏈球菌對(duì)