豬鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的耐藥機(jī)制及MefA-MsrD基因的全序列分析.pdf

1、目的：對(duì)臨床分離的48株豬鏈球菌進(jìn)行耐藥性篩選；檢測(cè)臨床分離48株豬鏈球菌中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)及四環(huán)素類(lèi)抗生素耐藥基因的分布；分析臨床分離的耐藥豬鏈球菌與體外誘導(dǎo)耐藥菌株的耐藥機(jī)制的差異；對(duì)臨床分離的4株含有mefA基因的豬鏈球菌中的mefA基因進(jìn)行定位，并對(duì)其上下游未知序列進(jìn)行分析。方法：采用微量稀釋法測(cè)定10種藥物對(duì)臨床分離的48株豬鏈球菌的體外最小抑菌濃度(MIC)及改良雙紙片法測(cè)定了48株菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的耐藥表型；建立PCR檢測(cè)方

2、法對(duì)分離菌株中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥基因ermA/B/C、 mefA、 msrD、 mphB、23S rRNA、L4、L22和四環(huán)素類(lèi)耐藥基因tetM、 tetO、 tetL、 tetK及與Tn916轉(zhuǎn)座子相關(guān)的int和xis基因進(jìn)行檢測(cè)；采用stepwise方法對(duì)敏感菌進(jìn)行紅霉素、泰樂(lè)菌素、阿奇霉素體外誘導(dǎo)耐藥；建立PCR檢測(cè)方法檢測(cè)體外誘導(dǎo)耐藥菌株耐藥基因ermB、 ermA、 ermC、 mefA、 msrD、 mphB的分布及擴(kuò)增23S

3、 rRNA及核糖體蛋白LA及L22;測(cè)定利血平存在的條件下，大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物對(duì)臨床分離和體外誘導(dǎo)耐藥菌株MIC的影響；采用DNA Walking（染色體步移技術(shù)）的方法獲mefA基因的相鄰未知序列并將所獲得的序列進(jìn)行拼接并在NCBI上進(jìn)行分析。結(jié)果：豬鏈球菌對(duì)紅霉素、泰樂(lè)菌素、替米考星及阿奇霉素的耐藥率分別達(dá)33.33％(16/48)、27.08％(13/48)、27.08％(13/48)和33.33％(16/48);對(duì)青霉素、氨芐西林、

4、阿莫西林、頭孢曲松鈉、頭孢喹肟均敏感，對(duì)四環(huán)素均耐藥；16株紅霉素耐藥菌株中，以?xún)?nèi)在型耐藥表型為主，占75％(12/16)，菌株MIC均為≥128mg·L-1;M型占25％(4/16)，大部分菌株MIC范圍為1mg·L-1;未檢測(cè)到誘導(dǎo)型耐藥表型；耐藥基因主要以ermB為主，占75％(12/16),mefA和msrD占25％(4/16),16株耐藥菌株中，tetM,tetO、int、xis的檢出率分別為31.25％(5/16)、62.5

5、％(10/16)、31.25％(5/16)和31.25％(5/16)，沒(méi)有檢測(cè)到ermA/C、mphB、tetL、tetK。所有耐藥菌株也均未檢測(cè)到核糖體23SrRNA、核糖體蛋白L4和L22突變；體外誘導(dǎo)的耐藥菌株均未檢測(cè)到大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物耐藥基因，耐藥機(jī)制的生主要是23SrRNA的位點(diǎn)A2061G、C2614A、A2062C及A2065C發(fā)生突變；核糖體蛋白L4的67-68之間插入S、Q及69-72位點(diǎn)插入W、P、Q、K和Q67R、K

6、68T、R73G的突變；核糖體蛋白L22的84-86位點(diǎn)上發(fā)生3個(gè)氨基酸的缺失及K87Q突變引起的；在利血平存在的條件下，紅霉素和阿奇霉素對(duì)具有mefA-msrD基因耐藥菌的MIC會(huì)發(fā)生變化；泰樂(lè)菌素及替米考星對(duì)泰樂(lè)菌素誘導(dǎo)的具有L22氨基酸缺失的兩株耐藥菌株的MIC有明顯變化；經(jīng)DNA Walking測(cè)序，共得到5305bp的基因片段，進(jìn)一步分析顯示mefA基因位于染色體DNA上，大小為1218bp，下游為msrD基因，大小為1464