豬鏈球菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因mefA-msrD的傳播機制與基因環(huán)境分析.pdf

1、豬鏈球菌為重要的人畜共患病原。目前報道豬鏈球菌對常用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn)生耐藥性比較嚴重，主要耐藥機制為ErmB介導(dǎo)的靶位修飾和MefA/MsrD介導(dǎo)的外排泵機制。Mef/Msr在豬鏈球菌中的流行機制仍不清楚。本文初步探討了mefA/msrD在豬鏈球菌中的傳播機制，旨在為控制耐藥菌的傳播擴散及藥物合理使用提供理論依據(jù)。
　　 本試驗首先采用PCR方法檢測了臨床分離豬鏈球菌的大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因mefA/msrD，并采用CLSI推薦的

2、微量稀釋法測定了攜帶mefA/msrD耐藥基因的菌株對大環(huán)內(nèi)酯類及其它抗菌藥的最小抑菌濃度(MIC);然后對攜帶mefA/msrD基因的菌株進行了噬菌體相關(guān)基因的檢測、噬菌體誘導(dǎo)和純化及電鏡觀察，進一步建立長距離PCR方法，擴增mefA/msrD基因上下游序列并測序，采用軟件Vector NTI對獲得的基因序列進行ORF分析及其上下游基因環(huán)境進行分析，初步判斷豬鏈球菌中攜帶mefA/msrD耐藥基因的基因元件;最后采用PFGE和MLST

3、技術(shù)對臨床分離的豬鏈球菌進行分子分型，分析其可能的傳播途徑。
　　 對2005-2007年分離的48株豬鏈球菌進行了mefA和msrD基因的檢測，共發(fā)現(xiàn)4株菌中含有大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因mefA/msrD，其中有1株為2型菌(YY060816)，3株為9型菌(N J-2、NJ-3與NJ-5);3株9型豬鏈球菌均對14-和15-元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素表現(xiàn)為低度耐藥，而2型菌株YY060816對所有大環(huán)內(nèi)酯類抗生素表現(xiàn)為高度耐藥;4株豬鏈球

4、菌均攜帶溶源性噬菌體基因，但菌株YY060816不合有phage capsid與phage terminase smallsubunit兩個基因;2型豬鏈球菌菌株YY060816與9型菌株NJ-5不能被絲裂霉素C誘導(dǎo);而9型菌株NJ-2與NJ-3可被絲裂霉素C誘導(dǎo)，誘導(dǎo)的噬菌體分離純化后通過透射電鏡觀察病毒粒子形態(tài)，可見誘導(dǎo)的噬菌體為正六面體，且有尾部;表明可能存在噬菌體介導(dǎo)mefA和msrD的傳播，插入到豬鏈球菌后以前噬菌體形式存在。

5、通過長距離PCR方法擴增到約23 kb的片段，合有24個ORF，其中5和6ORF分別為mefA和msrD基因，其插入位點在豬鏈球菌基因組的23S rRNA的尿嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶基因處，與Φm46.1、ΦSSUD基本一致，其它ORFs均為前噬菌體相關(guān)基因。臨床分離的豬鏈球菌均可被SmaⅠ作用，酶切片段分子量在10-913 kb，每株菌可切出5-13個條帶，以90％的相似度劃分克隆亞型，4株菌出現(xiàn)了3個PFGE譜型;根據(jù)等位基因序列號與UPGM

6、A系統(tǒng)進化樹圖譜，4株菌分屬3個ST型;菌株NJ-2與NJ-3同源性高于90％，并同屬于ST240，極有可能來源于同一克隆，為相同的流行病原;菌株YY060816屬ST7型，與已發(fā)表的四川疫情株有很高的同源性，為我國主要流行菌株，該菌株與NJ-2和NJ-3同源性僅有30％左右;菌株NJ-5屬于ST222型，其與NJ-2和NJ-3同源性接近50％，顯示為不同的克隆株。
　　 綜上所述，豬鏈球菌存在著雙重外排泵MefA和MsrD介導(dǎo)